Metody

Kategoria: Metody

Tagi: biologia molekularna DNA kwasy nukleinowe RNA

Data: 2009-02-05

Analiza typu Northern blot

Znakowanie sondy DNA

Przygotowanie próbek RNA do nanoszenia na żel

  1. Do próbek RNA (4-10 µg) w objętości 5 µl dodać 2 µl buforu 10× NBC (0,5 M kwas borowy, 10 mM octan sodu, 50 mM NaOH), 3 µl formaldehydu i 10 µl formamidu.
  2. Mieszaninę ogrzewać (5 min, 65°C) i po krótkim wirowaniu (10 s, 12000 obr./min) dodać 2 µl barwnika do nanoszenia na żel (15% Ficoll, 0,1 M EDTA pH 8,0, 0,025% błękit bromofenolowy, 0,025% cyjanoksylen).
  3. Próbki nanieść w całości na denaturujący żel agarozowy.

Przygotowanie żelu i elektroforeza

  1. W 80 ml buforu 1× NBC rozpuścić 0,8 g agarozy. Po schłodzeniu do ok. 65°C dodać 2 ml 37% formaldehydu i po wylaniu do saneczek pozostawić do zakrzepnięcia.
  2. Po naniesieniu próbek na żel elektroforezę prowadzić przy napięciu 100V do momentu, aż dolny barwnik (cyjanoksylen) osiągnął odległość ? długości żelu.
  3. Rozdzielone próbki RNA przenieść na błonę nitrocelulozową Hybond- N (Amersham Pharmacia Biotech) metodą transferu kapilarnego w obecności 10× SSC (1,5 M NaCl, 150 mM cytrynian sodu). Transfer prowadzić przez noc. RNA wiązać do błony przez naświetlanie światłem UV w aparacie Crosslinker (UVC 500 Hoefer) przy zastosowaniu energii 210 µJ/cm2.

Znakowanie sondy

  1. Jako matryce do znakowania wykorzystano produkty PCR oczyszczone z żelu agarozowego przy użyciu zestawu QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen).
  2. Sondy znakowano radioaktywnie stosując [a-32P]-dATP (3000 Ci · mmol-1) według protokołu dołączonego do zestawu do znakowania HexaLabel™ DNA Labeling Kit (Fermentas).
  3. Do znakowania brano 5 ng oczyszczonego produktu PCR. Wyznakowaną sondę oczyszczano od niewłączonych nukleotydów na kolumnie ze złożem Sephadex G-50 i denaturowano (100°C, 10 min).

Hybrydyzacja i detekcja zhybrydyzowanej sondy

  1. Utrwalone błony nitrocelulozowe poddać prehybrydyzacji w buforze PerfectHyb™ Plus (Sigma) przez 1-2 godz
  2. Następnie do roztworu prehybrydyzacyjnego dodawć zdenaturowaną sondę.
  3. Hybrydyzację prowadzić przez noc w temperaturze 65°C.
  4. Po tym czasie roztwór hybrydyzacyjny zlewano, a błonę przepłukać roztworami do płukania I (0,1% SDS, 2× SSC) i II (0,1% SDS, 0,2× SSC) odpowiednio przez 8 i 4 minuty.
  5. Ekspozycję błony prowadzić w kasecie fosforowej, i zczytać w urządzeniu Molecular Dynamics Storm-840 Imager wykorzystującym technikę fosfoobrazowania (ang. Phosphoimaging).

Analiza typu Northern blot w żelu akrylamidowym

Przygotowanie próbek RNA do nanoszenia na żel

  1. Do próbek RNA (5 µg) w objętości 3 µl dodać 7 µl formamidu.
  2. Mieszaninę ogrzeać (5 min, 65°C) i po krótkim wirowaniu (10 s, 12 obr./min) dodawano 1 µl barwnika do nanoszenia na żel (15% Ficoll, 0,1 M EDTA pH 8,0, 0,025% błękit bromofenolowy, 0,025% cyjanoksylen).
  3. Próbki nanieść w całości na denaturujący żel akrylamidowy.

Przygotowanie denaturującego żelu sekwencyjnego i elektroforeza

  1. Elektroforezę próbek RNA prowadzić w 5% denaturującym żelu akrylamidowym.
  2. W celu przygotowania żelu odważyć 21 g mocznika i dodawć do mieszaniny składającej się z 11,1 ml 45% roztworu akrylamid:bisakrylamid (27:1), 10 ml 5× TBE (0,45 M Tris, 10 mM EDTA pH 8,0, 0,45 M kwas borowy) i 17,9 ml wody mQ.
  3. Mieszaninę akrylamidu ogrzewać w łaźni wodnej (37°C) do momentu rozpuszczenia mocznika, filtrować przez filtr 45 µm i schładzić w lodzie do temperatury ok. 10°C.
  4. W celu wylania stopki pobierać 3 ml schłodzonej mieszaniny akrylamidu i dodawać 25 µl APS (10% roztwór nadsiarczanu amonu) i 4,5 µl TEMED (N,N,N',N'-tetrametylenodiamina).
  5. Po spolimeryzowaniu stopki do pozostałych 47 ml mieszaniny akrylamidu dodać 270 µl APS i 25 µl TEMED i wylać właściwy żel sekwencyjny.
  6. Żel pozostawić do polimeryzacji na noc.
  7. Przygotowany żel montować w aparacie do elektroforezy i zalewano 1× TBE.
  8. W celu rozgrzania żelu do 50-55°C prowadzić wstępną elektroforezę przez 45 minut przy mocy 55 W.
  9. Następnie nanieść przygotowane próbki i prowadzić dalszą elektroforezę do momentu kiedy dolny barwnik (cyjanoksylen) osiągnął dolny brzeg żelu.
  10. Rozdzielone próbki RNA przenieść na błonę nitrocelulozową Hybond-N (Amersham Pharmacia Biotech) metodą transferu mokrego w obecności 0,5× TBE. Transfer prowadzić w 4°C przez 1 godz. przy natężeniu 400 mA.
  11. RNA wiązać do błony przez naświetlanie światłem UV w aparacie Crosslinker (UVC 500 Hoefer) przy zastosowaniu energii 210 µJ/cm2.
  12. Dalsze postępowanie jest analogiczne do tego opisanego dla techniki Northern blot w żelu agarozowym

Autor: dr Janusz Piechota

Zapraszamy do dyskusji na ten temat na naszym forum http://metlab.pl/forum/topic36-analiza-typu-northern-blot.html