Badanie aktywności b-galaktozydazy .

Przygotowanie bakterii Escherichia coli

1. Nocną hodowle E. coli odmłodzić w stosunku 1:50 i hodować z wytrząsaniem w 37°C do OD6000,4
2. Inkubować na lodzie przez 20 min w celu zahamowania wzrostu. 2 ml hodowli wirować (6000 rpm, 10 min, 4°C), osad zawiesić w buforze Z i ponownie zmierzyć OD600

Przeprowadzenie testu

1. 500 µl zawiesiny komórkowej zmieszać z 500 µl buforu Z
2. Dodać 100 µl chloroformu i 50 µl 0,1% SDS, całość wymieszać i inkubować przez 5 min
3. Dodać 200 µl roztworu ONPG i ponownie odstawić do inkubacji w 28°C aż do momentu uzyskania żółtej barwy
4. Reakcję zatrzymać poprzez dodanie 500µl 1M Na2CO3
5. Mieszaninę zwirować(10000 rpm, 5 min) i mierzyć OD420 i OD550

Aktywność ß - galaktozydazy mierzona jest w jednostkach Millera i wyliczana ze wzoru:
1 jednostka Millera = 1000 x [(OD420 - 1,75 x OD550)] / (T x V x OD600).

gdzie:
T - czas reakcji w minutach
V - objętość zawiesiny komórkowej użytej do testu w ml
OD600 - absorbancja zawiesiny komórkowej w buforze Z
OD420 i OD600 - absorbancja mieszaniny reakcyjnej
Stąd 1 jednostka Millera zależna jest od A420/min/ml zawiesiny komórkowej/OD600.

Odczynniki:

Bufor Z

1. Na2HPO4*7H2O 0,06M
2. NaH2PO4*H2O 0,04M
3. KCl 0,01M
4. MgSO4 0,001M
5. ß-merkaptoetanol 0,05M
6. pH 7

Roztwór ONPG

1. ONPG 4 mg/ml buforu fosforanowego

Bufor fosforanowy

1. Na2HPO4*7H2O 0,06 M
2. NaH2PO4*H2O 0,04 M
3. pH7

Autor: dr Agnieszka Sałamaszyńska-Guz