Badanie ilości przeciwciał w surowicy -metodą ELISA.

1. 96-dołkowe polistyrenowe płytki opłaszczyć odpowiednim syntetycznym peptydem (antygenem) w tym celu do każdej studzienki dodać po 100µl roztworu peptydu (antygenu) o stężeniu 2 µg/ml w buforze węglanowym (NaHCO3 o pH 9,6).
2. Po dwunastogodzinnej inkubacji w temperaturze 4°C płytki przepłukać wodą destylowaną.
3. Pozostałe aktywne miejsca wysycać 1% roztworem BSA przez 2 godziny w temperaturze 37°C.
4. Badaną surowicę nakładać w rozcieńczeniu od 1:100 do 1:1 000 000 w objętości 200µl na studzienkę i inkubować dwie godziny w temperaturze pokojowej.
5. Płytki trzykrotnie płukać PBST (PBS + 0,1% Tween 20) i inkubować z II przeciwciałem skierowanym przeciwko króliczej globulinie sprzężonym z peroksydazą chrzanową HRP w rozcieńczeniu 1:10 000 w objętości 200 µl.
6. Po godzinnej inkubacji w temperaturze pokojowej, płytki ponownie trzykrotnie płukać PBST.
7. Dodać do studzienek po 100 µl roztworu tetrametylbenzydyny (TMB) (jako substratem HRP) w 0,1 M buforze cytrynianowym o pH 4.0.
8. Reakcję przerwać po 10 minutach 1N kwasem siarkowym.
9. Intensywność reakcji mierzyć spektrofotometrycznie przy długości fali 450 nm.

Przejdź do: ELISA (ang. enzyme-linked immunosorbent assay)

Autor: dr Joanna Skubis-Zegadło