Barwienie szkieletu aktynowego i jąder komórkowych.

Phalloidin jest toksyną pochodzącą z muchomora sromotnikowego (Amantia phalloides) silnie trującego grzyba. Związek ten ma zdolność wiązania polimerów aktynowych i stabilizacji ich struktury nie oddziałuje natomiast z monomerami aktynowymi lub innymi białkami cytoszkieletu komórki. Dlatego phalloidin połączony z fluorescencyjnym markerem jest bardzo dobrym narzędziem uwidaczniania aktyny zarówno w żywych jak i utrwalonych komórkach.

Przykład barwienia

Barwienie komórek w 96 dołkowych płytkach:

1. Utrwalić komórki 4% paraformaldehydem w następujący sposób: zostawić 50 ul pożywki hodowlanej i dodać taka samą objętość 8% paraformaldehydu.
2. Inkubować komórki 30 minut w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem.
3. Usunąć paraformaldehyd – wypłukać komórki 1x sterylnym PBS. Pozostawić jednak niewielką ilość PBS (50ul/dołek) aby nie dopuścić do wyschnięcia komórek.
4. Komórki inkubować z roztworem wysycającym przez noc w lodówce lub 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
5. Komórki wypłukać 2x PBS+0,1 TRITON X-100.
6. Dodać niewielka objętość (50ul) mieszaniny PHALLOIDIN-TRITC (1:333) + HOECHST (1:500) w PBS+0,1% TRITON X-100. Komórki inkubować przykryte przez godzinę w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem.
7. Komórki wypłukać 2x PBS i analizować w mikroskopie.