Metody

Kategoria: Metody

Tagi: białka in vitro linie komórkowe przeciwciała

Data: 2009-06-11

Barwienie szkieletu aktynowego i jąder komórkowych.

Phalloidin jest toksyną pochodzącą z muchomora sromotnikowego (Amantia phalloides) silnie trującego grzyba. Związek ten ma zdolność wiązania polimerów aktynowych i stabilizacji ich struktury nie oddziałuje natomiast z monomerami aktynowymi lub innymi białkami cytoszkieletu komórki. Dlatego phalloidin połączony z fluorescencyjnym markerem jest bardzo dobrym narzędziem uwidaczniania aktyny zarówno w żywych jak i utrwalonych komórkach.

przykład barwienia jąder i szkieletu aktynowego

Przykład barwienia

Barwienie komórek w 96 dołkowych płytkach:

  1. Utrwalić komórki 4% paraformaldehydem w następujący sposób: zostawić 50 ul pożywki hodowlanej i dodać taka samą objętość 8% paraformaldehydu.
  2. Inkubować komórki 30 minut w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem.
  3. Usunąć paraformaldehyd – wypłukać komórki 1x sterylnym PBS. Pozostawić jednak niewielką ilość PBS (50ul/dołek) aby nie dopuścić do wyschnięcia komórek.
  4. Komórki inkubować z roztworem wysycającym przez noc w lodówce lub 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  5. Komórki wypłukać 2x PBS+0,1 TRITON X-100.
  6. Dodać niewielka objętość (50ul) mieszaniny PHALLOIDIN-TRITC (1:333) + HOECHST (1:500) w PBS+0,1% TRITON X-100. Komórki inkubować przykryte przez godzinę w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem.
  7. Komórki wypłukać 2x PBS i analizować w mikroskopie.
Odczynniki:
  1. roztwór wysycający:
    1. 5% BSA
    2. 0,1% TRITON-X100
    3. PBS
  2. PHALLOIDIN-TRITC
    1. PHALLOIDIN-TRITC 1mg/ml
    2. metanol
  3. Autor: dr Joanna Skubis-Zegadło

Zapraszamy do dyskusji na ten temat na naszym forum http://metlab.pl/forum/topic84-barwienie-szkieletu-aktynowego-i-jader-komorkowych.html