Artykuły

Fluorescence complementation- przyżyciowe obrazowanie białek.

Istnieje wiele metod molekularnych pozwalających na obrazowanie białek w żywych komórkach. Jedną z najnowszych metod pozwalających na śledzenie wzajemnego oddziaływania molekuł w żywych komórkach jest metoda fluorescyjnego dopełniania BiFC (bimolecular fluorescence complementation). Przez ostatnie 5 lat technika ta była wykorzystywana bo badania molekularnych interakcji takich jak: oddziaływanie białko-białko, posttranslacyjne modyfikacje, zwijanie białek, zmiany konformacyjne, intereakcje RNA-białko.

Podstawową strategią opisywanej metody jest podział fluoryzującego białka (FB np: GFP- green fluorescent protein) na dwa niefluoryzujące fragmenty (FB-N, FB-C) a następnie łączenie ich z dwoma różnymi białkami (A+B), których wzajemne oddziaływanie będzie badane. Jeśli w komórce oba białka wzajemnie ze sobą oddziałują zbliży to niefluoryzujące fragmenty i nastąpi wznowienie fluorescencji. W ten sposób badano miedzy innymi wzajemne oddziaływanie czynników transkrypcyjnych FOS i JUN.

schemat oddziaływania dwóch białek

Rysunek: Badanie wzajemnego oddziaływania dwóch białek A+B, które połączono z dwoma fragmentami białka fluoryzującego (FB). Wzajemna interakcja obu białek skutkuje wznowieniem fluorescencji.

Opisywana technika pozwala również na badanie wzajemnych oddziaływań więcej niż tylko dwóch białek. W tym kontekście, N-końcowe fragmenty dwóch różnych białek fluorescencyjnych (BF1-N, BF2-N) są łączone do 2 analizowanych białek (A i C), a C-końcowy fragment (BF1-C), który może uzupełniać się z N-końcowymi fragmentami obu białek fluoryzujących (BF1 i BF2) łączony jest do trzeciego białka (B), Każde oddziaływanie pomiędzy białkiem B i jednym z dwóch białek połączonych z N-końcem doprowadzi do rekonstytucji fluorescencji: oddziaływanie białka A z B doprowadzi do rekonstrukcji pierwszego białka fluoryzującego (BF1) natomiast B z C do rekonstytucji drugiego (BF2). W ten sposób porównano zdolność do tworzenia kompleksów z podjednostką β1 siedmiu różnych γ podjednostek białka G.

schemat oddziaływania trzech białek

Rysunek: Badanie wzajemnego oddziaływania trzech białek (A+B+C). Białka A i C połączono z dwoma fragmentami dwóch różnych białek fluoryzujacych (FB1-N i FB2-C) natomiast białko C połączono z fragmentem białka fluoryzującego (FB1-C) komplementarnego do obu

Fluorescence complementation w połączeniu z metodą FRET (fluorescence resonance energy transfer) pozwala na identyfikację trójskładnikowych kompleksów. FRET jest to metoda oparta o przenoszenie energii pomiędzy chromoforem-donorem a akceptorem. Oba chromofory różnią się widmem apsorpcyjnym a gdy znajdują się w odległości mniejszej niż 10nm (taka odległość wskazuje na zachodzenie innterreakcji pomiędzy białkami) wzbudzając donor obserwujemy również emisje odpowiadającą akceptorowi. W tym przypadku, dwa badane białka (A i B) łączone są z dwoma niefluoryzującymi fragmentami jednego białka fluoryzującego (BF1-N, BF1-C). Trzecie białko (C) łączone jest do innego białka fluorescencyjnego (BF2). Interakcja pomiędzy białkami A i B odbudowuje fluorescencję pierwszego białka fluoryzującego (BF1), który następnie służy jako FRET akceptorowe. Jeżeli białko C(donor) wchodzi w interakcje z białkiem A albo B lub oboma na raz to następuje wzbudzenie donora przez akceptor i wzrost fluorescencji. Metoda ta zapewnia wygodne i bezpośrednie badanie trójskładnikowych kompleksów w żywych komórkach.

schemat oddzialywania Bi-FRET

Rysunek: Badane interakcji trzech białek. Białka A i B połączone są z dwoma fragmentami jednego białka fluoryzującego (BF1-N, BF1-C). Trzecie białko -C połączone jest z innym białkiem fluorescencyjnym (BF2). Połączenie A i B odbudowuje fluorescencję pierwszego białka fluoryzującego (BF1)akceptora. Interakcja białka C(donora) z białkami A i B pozwala, po wzbudzeniu donora na obserwanie również świecenia akceptora.

Opisywana technika, która obecnie bardzo dynamicznie się rozwija może w przyszłości pozwolić na analizę w jeszcze szerszym zakresie wzajemnych oddziaływań pomiędzy większą ilością białek.

Autor: dr Joanna Skubis-Zegadło

Na podstawie: Shyu, Y.J. et al. (2006) Biotechniques 40, 61-66.; Liu, H et al. EMBO J. 25, 1058-1069.; Shyu, Y.J. et al. (2008) Trends in biotechnology vol.26 No.11.

Zapraszamy do dyskusji na ten temat na naszym forum http://metlab.pl/forum/topic87-bimolecular-fluorescence-complementation-przyzyciowe-obrazowanie-bialek.html