Artykuły

Chromatografia jonowymienna

Chromatografia jonowymienna stosowana jest do rozdziału związków na podstawie różnicy ich ładunku elektrycznego. Metoda ta pozwala rozdzielić związki o niewielkiej różnicy ładunku i nie powoduje denaturacji białka.

Kolumnę chromatograficzną wypełnia się złożem posiadającym ładunek dodatni (wymieniacz anionów -anionit) lub ujemny (wymieniacz kationów -kationit).
Grupy polarne takie jak:

  1. dwuetyloaminoetylowa (DEAE) –OCH2CH2NH+(CH2CH3)2 (słaby anionit)
  2. aminoetyl (AE) –OCH2CH2NH3+ (słaby anionit)
  3. czwartorzędowa zasada aminowa (QAE) –OCH2CH2N+(C2H5)CH2-CH(OH)-CH3 (silny anionit)
  4. karboksymetylowa (CM) –OCH2COO- (słaby kationit)
  5. reszta kwasu sulfonowego (SP) –CH2CH2CH2SO3- (silny kationit)
  6. reszta kwasu fosforowego –PO4H2- (silny kationit)

dołączone są do różnego rodzaju obojętnego złoża: celulozy, agarozy, sephadexu, poliakrylamidu, polistyrenu i innych. Złoża te różnią się wielkością ziaren, porowatością itp.

Rozdział białek na kolumnie jonowymiennej następuje na podstawie odwracalnej adsorpcji białek na kolumnie. Białko,którego wypadkowy ładunek w obojętnym pH jest dodatni, będzie się wiązać z wymieniaczem jonowym poprzez jego grupy karboksylowe (z kationitem). Nie związane z kolumną związki (np. białka o ładunku ujemnym) zostaną wypłukane.

Związane białka o ładunku dodatnim wymywa się z kolumny np. buforem o zwiększającym się stężeniu chlorku sodu. Jony sodowe współzawodniczą z dodatnimi grupami białka o miejsca wiązania na złożu wypełniającym kolumnę. Jako pierwsze z kolumny będą wypływać białka o małej gęstości grup dodatnich natomiast białka o większej gęstości ładunków pojawia się później.

schemat chromatografii jonowymiennej

Rysunek: Rozdział białek związanych z kolumna zachodzi na zasadzie różnicy w powinowactwie do złoża.

Wielkość ładunku białka w roztworze zależy od jego punktu izoelektrycznego (takie pH w którym białko ma ładunek sumaryczny równy zeru) oraz od pH roztworu. Białko w buforach o pH powyżej swojego punktu izoelektrycznego będzie posiadać ładunek ujemny i będzie wiązane przez anionity, natomiast w buforach o pH poniżej swojego punktu izoelektrycznego będzie posiadać ładunek dodatni i będzie wiązane przez kationity. Dlatego do rozdziału tego samego białka można używać zarówno anionitów i kationitów. Wybór rozdziału będzie zatem zależał od punktu izoelektrycznego białka i jego stabilności w danym pH.

Autor: dr Joanna Skubis-Zegadło

Zapraszamy do dyskusji na ten temat na naszym forum http://metlab.pl/forum/topic43-chromatografia-jonowymienna.html