Artykuły

Kategoria: Artykuły

Tagi: białka chromatografia oczyszczanie

Data: 2009-02-23

Chromatografia powinowactwa

Chromatografia powinowactwa stosowana jest do rozdziału białek ze względu na ich duże powinowactwo do specyficznych ligandów, które związane są z nierozpuszczalnym złożem.
Procedura obejmuje następujące etapy:

  1. kowlaencyjne przyłączenie ligandu do złoża
  2. nałożenie mieszany białek a następnie przemycie kolumny w celu usunięcia niezwiązanych cząsteczek
  3. elucja związanych z kolumną białek.
schemat chromatografii powinowactwa

Rysunek: Białka o dużym powinowactwie do liganda (związanego ze złożu) łączą się ze złożem. Natomiast białka nie wykazujące takiego powinowactwa są wypłukiwane z kolumny.

Poniżej przedstawiono kilka najbardziej popularnych oddziaływań międzycząsteczkowych wykorzystywanych w chromatografii powinowactwa.

Związki oczyszczane Ligandy związane ze złożem
Enzymy inhibitory, koenzymy, substraty
Receptory hormony, witaminy, toksyny
Przeciwciała antygeny, hapteny
Pektyny cukry, polisacharydy, glikoproteiny
Kwasy nukleinowe nukleotydy, represory

Właściwości ligandów:

  1. co najmniej jedna grupa aktywna, która umożliwia związanie do złoża np. aminowa, amidowa, karboksylowa, hydroksylowa, tiolowa
  2. powinowactwo do związku oczyszczanego
  3. stabilność w warunkach reakcji wiązania do złoża

Wiązanie ligandów

Ligandy mogą być połączone bezpośrednio ze złożem lub poprzez „ruchome ramię” (spacer arm) w celu wyeliminowania niepożądanych oddziaływań sterczycznych ligand-złoże. Poprzez ramię łączy się ligandy o niskiej masie cząsteczkowej oraz takie, do których przy bezpośrednim połączeniu dostępność będzie ograniczona. Zwykle jako ramię stosuje się nie rozgałęziony łańcuch węglowodorowy, na którego końcu znajduje się grupa aktywna za pomocą której łączy się ligand.

  1. aktywacja złoża: złoże takie jak: celuloza, agaroza, sephadex, poliakrylamid i inne: aktywuje się z użyciem następujących odczynników (w nawiasach podano rodzaje wiązanych za pomocą tych odczynników ligandów):
    1. aldehyd glutarowy (białka, kwasy nukleinowe, aminy)
    2. bromek cyjanu (białka, kwasy nukleinowe, aminy)
    3. siarczan dwuwinylu (wielocukry, aminy, grupy tiolowe i fenolowe)
    4. benzochinon (białka, wielocukry, aminy)
    5. nadjodan (białka, kwasy nukleinowe, aminy)
    6. trójchloro-s-triazyna (białka, wielocukry, aminy)
    7. hydrazyna (białka, kwasy nukleinowe, aminy)
    8. epichlorohydryna (wielocukry, kwasy nukleinowe, aminy, grupy tiolowe i fenolowe).Na kolumnę z odpowiednim złożem (np. agaroza, sefadex, ...)
  2. łączy się ligand poprzez grupy ~SH. Białko powinno zawierać więcej niż 50% wolnych grup SH. Jeśli jest mniej należy białko zredukować (np. MET) w celu zwiększenia zawartości wolnych grup SH.
  3. przyłączanie ligandu do zaktywowanego złoża (inkubacja złoża z rozpuszczonym ligandem)
  4. wysycanie pozostałych aktywnych miejsc na złożu:
    Kolumnę inkubacje z etanoloaminą lub innymi aminami takimi jak: lizyna, glukozamina aby usunąć z kolumny pozostałe grupy aktywne nie połączone z ligandem. Połączone z ligandem złoże przechowuje się w obecności 0,02% azydku sodu lub mertiolatu w temperaturze 4°C.

Elucja białek z kolumny

Białka związane z kolumną eluuje się odpowiednim buforem najczęściej w jedno lub półmililitrowych frakcjach. Jako bufor elucyjny najczęściej stosuje się:

  1. roztwór liganda np.: konkanawalina A, ma powinowactwo do glukozy. Można ją oczyścić na kolumnie z kowalencyjnie połączonymi resztami glukozy. Białko można uwolnić z kolumny poprzez elucję stężonym roztworem glukozy.
  2. roztwory zawierające jony chaotropowe najczęściej 3M roztwór rodanku potasuWybrane złoże doprowadzić do temperatury pokojowej i zrównoważyć buforem, który będzie użyty do łączenia z ligandem (bufor do łączenia).
  3. roztwory o niskim pH np. bufor octanowy o pH 3.0, bufor glicynowy o pH 2.5-3 (Oczyszczanie przeciwciał metodą chromatografii powinowactwa)
  4. roztwory mocznika lub siarczanu dodecylu.

W przypadku denaturacji białka podczas procesu elucji należy pamiętać, aby proces elucji przeprowadzić możliwie jak najszybciej oraz możliwie szybko usunąć czynnik denaturujący z wyeluowanego białka np. poprzez podwyższenie pH roztworu Oczyszczanie przeciwciał metodą chromatografii powinowactwa lub dializę.

Przejdź do: Oczyszczanie przeciwciał metodą chromatografii powinowactwa

Autor: dr Joanna Skubis-Zegadło

Zapraszamy do dyskusji na ten temat na naszym forum http://metlab.pl/forum/topic73-chromatografia-powinowactwa.html