Metody

Kategoria: Metody

Tagi: białka chromatografia oczyszczanie

Data: 2009-02-21

Chromatografia żelowa

Chromatografia żelowa zwana również filtracją żelową stosowana jest do rozdziału białek różniących się masą cząsteczkową lub do oddzielania białek od składników niskocząsteczkowych np. sole (odsalanie) lub związki używane do znakowania białek np. J125, fluoresceina.

Kolumnę chromatograficzną wypełnia się złożem w postaci ziarenek o średnicy około 0,1 mm o zdefiniowanej wielkości porów zbudowanych z nierozpuszczalnego polimeru (typu: dekstran, agaroza) lub poliakrylamidu.Po nałożeniu na żel mieszaniny, białka o małych rozmiarach wnikają do wnętrza ziaren duże natomiast nie mogą. Droga do momentu wycieku z kolumny, którą musi pokonać każdy ze składników próbki jest więc nierówna. Cząsteczki o najmniejszym ciężarze cząsteczkowym mają do pokonania najdłuższą drogę i dlatego wypływają najpóźniej z kolumny. Białka o dużej masie cząsteczkowej i o efektywnej średnicy większej niż pory ziaren złoża mają do pokonania krótszą drogę w żelu i wędrują najszybciej. Ppojawiają się zatem jako pierwsze u wylotu kolumny.

schemat chromatografii żelowaej

Rysunek: Rozdzielanie białek różniących się wielkością. Pierwsze u wylotu kolumny pojawią się duże białka (maja do pokonania krótszą drogę). Małe białka wnikają w pory ziaren złoża przez co ich droga w żelu wydłuża się i dlatego z kolumny wypływają później.

Warunki rozdziału

Do filtracji żelowej najczęściej stosuje się kolumny o długości 50-90 cm, wraz ze wzrostem długości kolumny zmniejsza się szybkość rozdziału białek. Objętość nakładanej próby nie powinna przekraczać 5% całkowitej objętości kolumny. Skład buforu elucyjnego nie wpływa bezpośrednio na rozdział białek, ale w celu zmniejszenia oddziaływań jonowych pomiędzy złożem a rozdzielanymi związkami nie stosuje się buforów o sile jonowej słabszej niż 0,02M.

Autor: dr Joanna Skubis-Zegadło

Zapraszamy do dyskusji na ten temat na naszym forum http://metlab.pl/forum/topic42-chromatografia-zelowa.html