Metody

Defosforylacja białek na membranie PVDF (alkaliczna fosfataza)

Odłączenie grup fosforanowych od białek za pomocą fosfatazy alkalicznej np. pochodzącej z cielęcego jelita (ang. calf instetine alkaline phosphatise -CIAP) może być stosowane jako kontrola specyficzności fosfo-specyficznych przeciwciał.

  1. Przepłucz membranę PVDF 2x TBST (niewysyconą membranę z rozdzielonymi na niej białkami po western-blotingu)
  2. Inkubuj 2-10 u CIAP w odpowiednim buforze reakcyjnym od 2h do nocy w 37ºC (odpowiedni czas inkubacji jak również ilość CIAP powinna być ustalona doświadczalnie)
  3. Wysyć membranę a następnie inkubuj ją z I i II rzędowymi przeciwciałami.

Przystępując do doświadczenia pamiętaj aby nie używać następujących związków, które hamują aktywność fosfatazy:

  1. NaF
  2. ortovanad sodu
  3. EDTA
  4. PBS (zawiera jony fosforanowe, które hamują aktywność fosfatazy)

Przejdź do: Defosforylacja białek z użyciem fosfatazy alkalicznej. Defosforylacja białek w lizatach komórkowych.

Autor: dr Joanna Skubis-Zegadło

Zapraszamy do dyskusji na ten temat na naszym forum http://metlab.pl/forum/topic111-defosforylacja-bialek-na-membranie-pvdf-alkaliczna-fosfataza.html