Defosforylacja białek w lizatach komórkowych z użyciem alkalicznej fosfatazy

1. Przygotuj bufor lizującay ze świeżymi inhibitorami proteaz bez inhibitorów fosfatazy (między innymi: NaF, ortovanad sodu, EDTA)
2. Przygotuj mieszaninę reakcyjną: 0,1-0.2mg/ml białek na 10 U enzymu (ilość alkalicznej fosfatazy powinna być ustalona doświadczalnie) w buforze reakcyjnym dla fosfatazy (przeważnie załączony przez producenta). Reakcje przeprowadza się przez godzinę w 37C.

Przystępując do doświadczenia pamiętaj aby nie używać następujących związków, które hamują aktywność fosfatazy:

1. NaF
2. ortovanad sodu
3. EDTA
4. PBS (zawiera jony fosforanowe, które hamują aktywność fosfatazy)

Przejdź do: Defosforylacja białek z użyciem fosfatazy alkalicznej. Defosforylacja białek na membranie PVDF (alkaliczna fosfataza).

Autor: dr Joanna Skubis-Zegadło