Metody

Kategoria: Metody

Tagi: białka immunodetekcja przeciwciała

Data: 2009-02-20

ELISA (ang. enzyme-linked immunosorbent assay).

Test ELISA jest jednym z najpowszechniej stosowanych testów immunoenzymatycznych. Wykonuje się go na 96 dołkowych płytkach (polistyrenowych lub pleksiglasowych). Stosuje się wiele różnych wariantów testu ELISA, poniżej przedstawiono wybrane z nich.

Test ELISA - pośredni

Pierwszym etapem testu jest związanie (opłaszczenie) antygenu na podłożu (1). Przeprowadza się to przez dodanie do studzienki roztworu opłaszczanej substancji i inkubację noc w 4°C. Następnie blokuje się miejsca niezajęte przez antygen za pomocą czynników blokujących, np. roztworu owoalbuminy. Etap ten zapobiega nieselektywnemu przyłączaniu się badanych białek do fazy stałej podczas następnych etapów testu. Kolejnym krokiem jest inkubacja z roztworem przeciwciała, specyficznym do badanego białka (2). Przeciwciało po związaniu białka uwidacznia się poprzez dodanie drugorzędowego przeciwciała (3) (skierowanego przeciwko globulinie zwierzęcia z którego pochodzi przeciwciało pierwszorzędowe). Przeciwciało drugorzędowe związane jest z enzymem (najczęściej z peroksydazą chrzanową lub fosfatazą alkaliczną). Po dodaniu substratu (4) odpowiedniego dla danego enzymu pojawi się reakcja barwna a jej intensywność świadczy o ilości badanego białka w próbie. Ten schemat reakcji ELISA jest najczęściej stosowany i służy do wykrywania ilości badanego białka w próbie (homogenaty tkankowe) oraz w badaniach diagnostycznych np. do ustalenia miana przeciwciał we krwi.

schemat testu elisa

Rysunek: test ELISA- pośredni. 1-opłaszczanie płytki antygenem. 2-inkubacja z przeciwciałem pierwszorzędowym (o wysokim powinowactwie do antygenu). 3-inkubacja z przeciwciałem drugorzędowym. 4-inkubacja z odpowiednim substratem.

Test ELISA- bezpośredni

Pierwszym etapem testu jest związanie (opłaszczenie) antygenu (1). Następnie blokuje się miejsca niezajęte przez antygen. Kolejnym etapem jest inkubacja z roztworem przeciwciała, specyficznym do badanego białka wyznakowanych odpowiednim enzymem (znakowanie przeciwciał) (2). Po dodaniu substratu odpowiedniego dla danego enzymu (3) pojawi się reakcja barwna a jej intensywność świadczy o ilości badanego białka w próbie.

schemat testu elisa test bezpośredni

Rysunek: test ELISA- bezpośredni. 1-opłaszczanie płytki antygenem. 2-inkubacja z przeciwciałem pierwszorzędowym (połączopnym z enzymem). 3-inkubacja z odpowiednim substratem powodująca reakcję.

Test ELISA podwójnego wiązania: "Sandwich"

Ten schemat reakcji ELISA jest stosowany do wykrywania ilości badanego białka w próbie. W doświadczeniu antygen umieszczony jest pomiędzy dwoma przeciwciałami. Używane przeciwciała mają powinowactwo do różnych fragmentów łańcucha aminokwasowego badanego białka. Pierwszym etapem testu jest związanie (opłaszczenie) przeciwciał specyficznych do badanego białka na podłożu i blokuje się miejsca niezajęte przez przeciwciała. Następnie płytkę inkubuje się z antygenem. Kolejnym etapem jest inkubacja z roztworem innego przeciwciała również specyficznego do badanego białka związanego z odpowiednim enzymem. Po dodaniu substratu odpowiedniego dla danego enzymu pojawi się reakcja barwna a jej intensywność świadczy o ilości badanego białka w próbie.

schemat testu elisa test sandwich

Rysunek: "Sandwich" ELISA. 1-opłaszczanie płytki antygenem-przeciwciałem. 2-inkubacja z z badanym białkiem. 3-inkubacja z przeciwciałem pierwszorzędowym (o wysokim powinowactwie do badanego białka). 3-inkubacja z przeciwciałem drugorzędowym. 4-inkubacja z odpowiednim substratem powodująca reakcję.

Kompetycyjny test ELISA

W kompetycyjnych (rywalizacyjnych) testach ELISA (c-ELISA, z ang. competitive ELISA) wykorzystuje się współzawodnictwo o miejsca wiązania na antygenie mieszaniny różnych przeciwciał. W schemacie doświadczenia wyróżnia się metodę pośrednią oraz bezpośrednią (z wykorzystaniem wyznakowanych enzymem przeciwciał pierwszorzędowych).

Kompetycyjny test ELISA - metoda pośrednia

Płytka opłaszczona antygenem (badanym białkiem) i wysycona. Kolejnym etapem jest inkubacja z mieszaniną: surowica (badana na obecność przeciwciał anty-opłaszczony antygen) oraz monoklonalne przeciwciało skierowane przeciwko antygenowi pochodzące z innego gatunku. Jeśli testujemy ludzka surowicę przeciwciało nie może być ludzkie tylko np. mysie. Następnie dodajemy II przeciwciało skierowane przeciwko globulinie zwierzęcia z którego pochodziło przeciwciało monoklonalne. Po dodaniu substratu powstała reakcja barwna mówi nam o zawartości przeciwciała anty-antygen w surowicy. Im reakcja jest większa tym przeciwciał anty-antygen w surowicy jest mniej. Z antygenem wiąże się więcej znakowanych przeciwciał.

Kompetycyjny test ELISA - metoda bezpośrednia

Płytka opłaszczona antygenem (badanym białkiem) i wysycona. Kolejnym etapem jest inkubacja z mieszaniną: surowica (badana na obecność przeciwciał anty-opłaszczony antygen) oraz monoklonalne przeciwciało skierowane przeciwko antygenowi znakowane enzymem (patrz znakownie przeciwciał). Po dodaniu substratu powstała reakcja barwna mówi nam o zawartości przeciwciała anty-antygen w surowicy. Im reakcja jest większa tym przeciwciał anty-antygen w surowicy jest mniej. Z antygenem wiąże się więcej znakowanych przeciwciał.

Przejdź do: Badanie ilości przeciwciał w surowicy -metodą ELISA.

Autor: dr Joanna Skubis-Zegadło

Zapraszamy do dyskusji na ten temat na naszym forum http://metlab.pl/forum/topic59-elisa-ang-enzymelinked-immunosorbent-assay.html