Metody

Kategoria: Metody

Tagi: białka biochemia biotechnologia oczyszczanie

Data: 2009-01-13

Elektroforetyczny rozdział białek

Elektroforeza polega na rozdziale mieszaniny makrocząsteczek pod wpływem przyłożonego pola elektrycznego. Cząsteczki wędrują w żelu w zależności od ich ładunku, rozmiaru, kształtu oraz oporów ruchu środowiska (gęstości żelu). Elektroforezę najczęściej prowadzi się na żelach poliakrylamidowych.

Żele poliakrylamidowe

Żele poliakrylamidowe używane w metodzie western-blot do rozdziału białek są polimerami akrylamidu i bis-akrylamidu.Od proporcij tych dwóch składników zależy gęstość i wymiary porów żelu. Wybór gęstości żelu uzależniony jest od wielkości i masy cząsteczkowej analizowanych cząsteczek. Wysoko-cząsteczkowe białka rozdziela się na żelach o niższej gęstości natomiast nisko-cząsteczkowe na żelach bardziej gęstych. (8%żel: 24kDa-205kDa, 10%żel: 14kDa-205kDa, 12%żel: 14-66)

Bardzo często żele poliakrylamidowe wzbogacane są w siarczan dodecylu –SDS (SDS-PEAGE). Dzięki któremu rozdział elektroforetyczny zachodzi ze względu na ciężar cząsteczkowy rozdzielanych białek a nie ich ładunek (SDS opłaszcza białka nadając im wypadkową ujemną wartość -przez co maskuje ich pierwotny ładunek). W polu elektrycznym ujemnie naładowane białka migrują w kierunku dodatniej elektrody.
Istotnym czynnikiem wpływającym na dobry rozdział białek w żelu poliakrylamidowym jest:

  1. odpowiednia szybkość reakcji. (Zbyt szybka migracja białek w żelu może powodować ich niecałkowity rozdział).
  2. temperatura buforów. (zbyt wysokie napięcie może skutkować podwyższeniem temperatury i denaturacją badanych białek).

Elektroforezę prowadzi się przy napięciu prądu od 100-180V. Czas elektroforezy zwykle zależy od napięcia prądu i kończy się z chwilą osiągnięcia dolnych krawędzi żelu przez czoło. Po skończonej elektroforezie można wybarwić żel (detekcja białek w żelu) lub przetransferować białka na membranę (nitrocelulozową albo PVDF) (transfer białek na membranę i immunodetekcja białek).

Przygotowanie żelu do elektroforezy

Żel poliakrylamiodowy wylewa się dwustopniowo. Najpierw żel rozdzielający o procentowości zależnej od potrzeb. Tutaj ma miejsce właściwy rozdział białek. Na wylany żel rozdzielający nanosi się izobutanol w celu usunięcia ewentualnych bąbli powietrza oraz aby zapobiec dostępowi powietrza, który utrudnia polimeryzację. Żel polimeryzuje nie krócej niż 30 minut. Po tym czasie należy wypłukać izobutanol z góry żelu i delikatnie osuszyć go bibułą, nie dopuszczając do przesuszenia górnej warstwy żelu. Następnie wylewa się żel górny 4% tzw. żel zagęszczający, w którym należy umieścić grzebień tak, by w studzienkach nie było pęcherzyków powietrza.

Aby wylać żel zbierający 4% i żel rozdzielający 9% należy zmieszać składniki w następujących proporcjach:

skład żel 4% żel 9%
woda 3 ml 4,3 ml
1,5M Tris 1,25ml 2,5ml
10% SDS 50µl 100µl
30%akrylamid 0,625 ml 3ml
10% persulfat (APS) 35µl 50µl
TEMED 5µl 5µl

Ostatnie dwa składniki (10% persulfat i TEMED), które inicjują proces polimeryzacji należy dodać przed samym wylaniem żelu.

Elektroforeza natywna białek

Elektroforeza natywna białek – jest przeciwieństwem elektroforezy w obecności czynników redukujących np. SDS. Próbka nakładana na żel rozpuszcza się w buforze nie powodującym denaturacji zawartych w niej białek.

Przygotowanie próbek do elektroforezy

Aby rozdział elektroforetyczny zachodził ze względu na ciężar białka próbkę przed nałożeniem na żel należy zredukować w odpowiednim buforze redukującym i temperaturze. W buforach redukujących stosuje się: merkaptoetanol lub DTT (ditiotreitol) oba związki redukują (przecinają) mostki dwusiarczkowe (S-S) pomiędzy białkami czyli denaturują drugorzędową strukturę białka. Taki zabieg ma na celu wykluczenie, że biako o większej masie ale bardziej „upakowane ” wędruje szybciej w żelu niż białko o mniejszej masie za to mniej „upakowane”. Dobry rozdział elektroforetyczny osiąga się wtedy, gdy objętość próbki nie przekracza 10% objętości ścieżki, a ilość białek nakładanych na studzienkę znajduje się w przedziale 1-50 µg. Ponadto próbka nie może zawierać zbyt dużej ilości soli, która w postaci zjonizowanej powoduje powstawanie smug i niejednorodności prążków.

  1. Odpowiednią ilość białka (1ng-50µg) zawiesić w buforze do próbek. (Docelową objętość jaka ma być nałożona na studzienkę około 10-30 µl podzielić na pół. Jedną połowę stanowi bufor do próbek stężony 2x a drugą badana próbka rozcieńczona w odpowiedniej ilości wody, lub buforu do elektroforezy)
  2. Zredukować próbki poprzez dodanie: 1% merkaptoetanolu lub DTT. Redukcje prowadzić przez 5 minut w 100°C
  3. Bezpośrednio przed naniesieniem na żel próbkę należy odwirować aby usunąć wszystkie nierozpuszczone składniki
  4. Nanieść badane białko oraz marker wielkości na studzienki w żelu poliakryloamidowym
  5. Elektroforezę prowadzić w buforze do elektroforezy poczatkowo przy napięciu 80V -20 minut (mniejsze napięcie ma na celu wyrównanie ładunków w żelu oraz wolniejszą migrację białek w żelu zbierającym) a następnie przy napięciu prądu 150 V przez ok. 50 minut
  6. Po zakończonej elektroforezie w zależności od potrzeb: wybarwić żel (detekcja białek w żelu) lub elektrotransferować go na membranę nitrocelulozową lub PVDV (transfer białek na membranę i immunodetekcja białek).
Odczynniki:
  1. bufor do próbek – sb(sample buffer)–2xstężony, przepis wg. mercka(hefera)
    1. 0,5 M TRIS-HCl o pH 6,8 (st. końcowe 0,125 M)
    2. 4% SDS
    3. 20 %glicerol
    4. bromofenol blue (dodawać kroplami dla uzyskania odpowiedniego granatowego koloru)
  2. bufor do elektroforezy (5xstężony)
    1. 25mM Tris
    2. 192mM glicyna
    3. 0.1% SDS pH 8.3

Przejdź do: detekcja białek w żelu; transfer białek na membranę i immunodetekcja białek western-blotting- podstawy teoretyczne western-blotting- przepis

Autor: dr Joanna Skubis-Zegadło

Na podstawie: Bier M. red. Electrophoresis. Academic Prus, New York, 1959;
Ostrowski W. Elektroforeza w badaniach biochemicznych i klinicznych, PWN, Warszawa, 1970

Zapraszamy do dyskusji na ten temat na naszym forum http://metlab.pl/forum/topic65-elektroforetyczny-rozdzial-bialek.html