Artykuły

Immunofluorescencja : utrwalanie komórek i permeabilizaja błon.

Immunofluorescencyjne barwienie jest powszechnie stosowaną techniką pozwalającą śledzić obecność (ekspresję) lub lokalizacje docelowego białka w komórce. W skrócie technika ta polega na reakcji specyficznych przeciwciał z docelowym białkiem (antygenem). Kompleks przeciwciało-antygen jest wykrywany za pomocą przeciwciał drugorzędowych połączonych z markerem fluoryzującym. Wynik doświadczenia analizowany jest w mikroskopie fluorescencyjnym.

Pierwszym etapem barwienia immunohistofluorescyjnego komórek jest ich utrwalenie oraz/lub permeabilizacja błony komórkowej. Etapy te mają na celu umożliwienie przeciwciałom łatwą penetrację zarówno poszczególnych komórek jak i białek wewnątrzkomórkowych.

Używane podczas procedury bufory, odczynniki do utrwalania i permeabilizacji komórek mogą znacząco wpłynąć na zachowanie komórek, a niektóre przeciwciała wiążą antygen tylko w szczególnych warunkach utrwalania. Istnieje kilka sposobów na utrwalanie i/lub permeabilizację komórek np.

    1. PFA
    2. -20ºC metanol
    3. -20ºC aceton
    4. 1:1 (-20ºC) metanol/aceton

Wybór metody zależy od wrażliwości zarówno epitopów jak i przeciwciał, i przeważnie wymaga optymalizacji.

Przed przystąpieniem do immunobarwienia komórek należy doświadczalnie ustalić który sposób zarówno utrwalenia komórek jak i permabilizacji błon będzie najlepszy dla konkretnych przeciwciał. Dla przeciwciał o nieustalonych doświadczalnie warunków utrwalania komórek najlepiej zacząć od utrwalania, które zachowuje natywną strukturę białek (np. PFA) oraz warunki utrwalania, które denaturują białka (metanol, aceton). Często stosowanym sposobem jest utrwalanie i permeabilizacja jednocześnie. Generalnie permeabilizajcęe należny wykonywać w przypadku barwienia białek wewnątrzkomórkowych, aby umożliwić przeciwciałom penetracje poprzez błonę komórkową wewnętrznych przedziałów komórkowych oraz białek przezbłonowych jeśli ich epitopy znajdują się w części cytoplazmatycznej. W przypadku barwienia białek błonowych prmabilizacja może je uszkadzać i nie jest zalecana

Poniżej opis najczęściej stosowanych odczynników do immunobarwienia

  1. 4% Paraformaldehyd
    1. Utrwalenie z zachowaniem natywnej struktury białek.
  2. Etanol lub Metanol
    1. Utrwalanie metanolem denaturuje białka.
    2. Metanol również permabilizuje błony, ale nie we wszystkich przypadkach
  3. Aceton
    1. Aceton denaturuje białka jak również permealizuje.
    2. Dodatkowa permealizacja nie jest wymagana. Może on być również stosowany do samej permeabilizacji po utrwaleniu komórek z innym odczynnikiem.
  4. Detergenty
    1. Triton or NP-40 (Silne detergenty. Częściowo rozpuszczają błony jądrowe przez co są bardzo użyteczne do barwienia antygenów jądrowych.)
    2. Tween 20, Saponin, Digitonin and Leucoperm (Łagodniejsze detergenty nie rozpuszczają błon komórkowych, ale są wystarczające do wykonania porów umożliwiających przeciwciałom penetrację błony komórkowej. Odpowiednie dla cytoplazmatycznych antygenów oraz jądrowych.)

Przejdź do: Immunofluorescencyjne barwienie z użyciem paraformaldehydu (PFA) Immunofluorescencyjne barwienie z użyciem metanolu.; Barwienie szkieletu aktynowego i jąder komórkowych.

Autor: dr Joanna Skubis-Zegadło

Zapraszamy do dyskusji na ten temat na naszym forum http://metlab.pl/forum/topic104-immunofluorescencja-immunofluorescence-utrwalanie-komorek-i-permeabilizaja-blon.html