Metody

Kategoria: Metody

Tagi: chemiluminescencja immunodetekcja przeciwciała

Data: 2009-09-17

Immunofluorescencyjne barwienie z użyciem paraformaldehydu (PFA)

  1. Utrwal komórki poprzez delikatne dodanie takiej samej objętości 8% paraforaldehydu (PMA) do komórek z medium (końcowe stężenie PFA w utrwalanych komórkach wyniesie 4%). Inkubuj komórki 15 minut w 37ºC .
  2. Usuń PFA i przemyj komórki raz PBS-0.01% Tween
  3. Inkubuj komórki z 0.3% Triton X-100 w PBS przez 5 min w (RT) (permabilizacja błon komórkowych)
  4. Usuń 0.3% Triton X-100 w PBS i dodaj 3% BSA w PBS for 30min at RT w celu blokowania niespecyficznych wiązań
  5. Dodaj przeciwciało pierwszorzędowe w 3% BSA-PBS i inkubuj 1 godzinę w RT
  6. Przepłucz 3 x PBS-0.01% Tween
  7. Dodaj drugorzędowe przeciwciało z fluorescencujnym markerem w 3% BSA-PBS inkubuj 30 min w RT (chroniąc przed dostępem światła).
  8. Przepłucz 3 x PBS-0.01% Tween
  9. Jeśli barwisz komórki na szkiełkach dodaj 2 krople medium wiążącego i przykryj szkiełkiem nakrywkowym jeśli barwisz komórki na szalkach lub płytkach przechowuj komórki w PBS do czasu analizy. Do czasu analizy komórki muszą być chronione przed światłem.
Odczynniki:
    Przygotowanie 8% PFA
    1. Odważ 8g PFA. Uwaga PFA jest bardzo toksyczny!
    2. Dodaj ~ 80ml PBS I dodaj kilka kropli stężonego NaOH.
    3. Użyj podgrzewanego mieszadła magnetycznego I mieszaj odczynnik w temp 60ºC pod wyciągiem z otwartą przykrywką.
    4. Po całkowitym rozpuszczeniu doprowadź PFA do RT
    5. Ustal ph pH 7.0 i dopełnij do 100ml z PBS.
    6. 8% PFA może być rozdozowany i przechowywany -20ºC.

Autor: dr Joanna Skubis-Zegadło

Zapraszamy do dyskusji na ten temat na naszym forum http://metlab.pl/forum/topic101-immunofluorescencyjne-barwienie-z-uzyciem-paraformaldehydu-pfa.html