Immunofluorescencyjne barwienie z użyciem paraformaldehydu (PFA)
- Utrwal komórki poprzez delikatne dodanie takiej samej objętości 8% paraforaldehydu (PMA) do komórek z medium (końcowe stężenie PFA w utrwalanych komórkach wyniesie 4%). Inkubuj komórki 15 minut w 37ºC .
- Usuń PFA i przemyj komórki raz PBS-0.01% Tween
- Inkubuj komórki z 0.3% Triton X-100 w PBS przez 5 min w (RT) (permabilizacja błon komórkowych)
- Usuń 0.3% Triton X-100 w PBS i dodaj 3% BSA w PBS for 30min at RT w celu blokowania niespecyficznych wiązań
- Dodaj przeciwciało pierwszorzędowe w 3% BSA-PBS i inkubuj 1 godzinę w RT
- Przepłucz 3 x PBS-0.01% Tween
- Dodaj drugorzędowe przeciwciało z fluorescencujnym markerem w 3% BSA-PBS inkubuj 30 min w RT (chroniąc przed dostępem światła).
- Przepłucz 3 x PBS-0.01% Tween
- Jeśli barwisz komórki na szkiełkach dodaj 2 krople medium wiążącego i przykryj szkiełkiem nakrywkowym jeśli barwisz komórki na szalkach lub płytkach przechowuj komórki w PBS do czasu analizy. Do czasu analizy komórki muszą być chronione przed światłem.
-
Przygotowanie 8% PFA
- Odważ 8g PFA. Uwaga PFA jest bardzo toksyczny!
- Dodaj ~ 80ml PBS I dodaj kilka kropli stężonego NaOH.
- Użyj podgrzewanego mieszadła magnetycznego I mieszaj odczynnik w temp 60ºC pod wyciągiem z otwartą przykrywką.
- Po całkowitym rozpuszczeniu doprowadź PFA do RT
- Ustal ph pH 7.0 i dopełnij do 100ml z PBS.
- 8% PFA może być rozdozowany i przechowywany -20ºC.
Autor: dr Joanna Skubis-Zegadło
