Artykuły

Kategoria: Artykuły

Tagi: białka immunodetekcja przeciwciała

Data: 2009-10-05

Włączenie inhibitorów fosfataz podczas western-blotingu wzmacnia detekcję sygnału z użyciem fosfo-specyficznych przeciwciał.

Fosforylacja białek odgrywa ważną rolę w wielu procesach przebiegających w komórce. Wiele białek jest aktywowanych za pomocą fosforylacji co oznacza, że poziom ich fosforylacji jest często uważany za miarę aktywności tych białek. Dlatego wykorzystanie przeciwciał rozpoznających tylko ufosforylowane formy białek jest bardzo pomocne podczas identyfikacji stanu aktywności fosforylowanych białek.

Aktywność fosfataz w komórce rozpozna się już podczas lizy komórek, dlatego podczas pracy z ufosforylowanymi formami białek ważne jest włączenie odpowiednich inhibitorów fosfataz do buforu lizującego. Niemniej jednak jak sugerują autorzy prezentowanej pracy pewien stopień defosforylacji może nadal zachodzić w końcowej fazie western-blotingu podczas zarówno wysycania membrany jak również inkubacji jej z przeciwciałami.

Autorzy publikacji badali intensywność reakcji przeciwciał rozpoznających ufosforylowane formy białek po włączeniu inhibitorów fosfataz podczas reakcji western-blot. Do doświadczenia wykorzystali:

    1. fluorek sodu o stężeniu 10, 20, 50mM (inhibitor fosfataz: seryno/treoninowych)
    2. ortowanad sodu o stężeniu 1, 2, 5mM (inhibitor fosfatazy tyrozynowej)

Dodanie wyżej wymienionych inhibitorów fosfataz do roztworu wysycającego oraz do roztworu z pierwszo i drugorzędowymi przeciwciałami spowodowało zwiększenie sygnału pochodzącego od fosfo-specyficznych przeciwciał:

    1. 2,5 krotnie (przy stężeniu NaF: 20mM i ortowanadanu sodu: 2mM)
    2. 3 krotnie (przy stężeniu NaF: 50mM i ortowanadanu sodu: 5mM)

Wykonana równocześnie kontrola z przeciwciałami rozpoznającymi nieufosforolywane formy tych samych białek nie wykazała istotnych zamian w intensywności. Autorzy sugerują zatem, że efektywność sygnału przeciwciał rozpoznających fosforylowane formy białek może być zależna od kontaminacji wolnymi fosfatazami podczas wysycania membrany oraz inkubacji jej z przeciwciałami.

Użycie inhibitorów fosfataz podczas reakcji western-blot chroni rozdzielone na membranie białka przed defosforylacją i zwiększa intensywność reakcji przeciwciał rozpoznających ufosforylowane formy białek.

Autor: dr Joanna Skubis-Zegadło

Na podstawie: Inclusion of phosphatase inhibitors during Western blotting enhances signal detection with phospho-specific antibodies. Sharma SK, Carew TJ. Anal Biochem. 2002 Aug 1;307(1):187-9

Zapraszamy do dyskusji na ten temat na naszym forum http://metlab.pl/forum/topic105-inhibitory-fosfataz-moga-wzmacnic-detekcje-sygnalu-z-uzyciem-fosfospecyficznych-przeciwcial.html