Metody

Izolacja RNA z tkanek utrwalonych w parafinie (FFPE, formalin-fixed, paraffin-embedded)

Z uwagi na trudności z pozyskiwaniem próbek tkanek do analizy bezpośrednio z sekcji, bardzo wartościowym materiałem wydają się być zbiory tkanek utrwalonych formaliną. Jednakże o ile w przypadku badań histochemicznych jest to bardzo dobry materiał, o tyle w przypadku analizy kwasów nukleinowych, a zwłaszcza RNA występują dość znaczne ograniczenia. RNA pozyskiwane z tkanek FFPE charakteryzuje się niską jakością spowodowaną znacznym stopniem degradacji, która zachodzi jeszcze przed zakończeniem procesu utrwalania w roztworze formaliny. Ponadto, samo utrwalanie powoduje powstawanie wiązań krzyżowych pomiędzy cząsteczkami kwasów nukleinowych i białek, jak również wprowadza modyfikacje kowalencyjne RNA. Powyższe ograniczenia znacząco utrudniają izolację oraz ilościową i jakościową analizę RNA. W przypadku metody RT-PCR konieczne jest takie zaprojektowanie starterów , aby produkt reakcji był nie większy niż 200 par zasad.

  1. Parafina z badanych próbek (20-50 mg) była usuwana przez kolejne płukania przy użyciu ksylenu (4-8-krotne) i alkoholu etylowego (99,8%, 3-4-krotne)
  2. Następnie badana tkanka była suszona, homogenizowana w 850µl buforu denaturujacego z dodatkiem 250 µl roztworu proteinazy K (20 mg/ml), zgodnie z Lehmann i Kreipe (Lehmann, U., and Kreipe, H. 2001 Methods 25:409-418.) i inkubowana w 55°C przez noc (16-18 godzin)
  3. Następnego dnia próbka była odwirowywana ( 14 000 g, 5 min, 4°C). Do otrzymanego supernatantu (200 µl) dodawano 1 ml odczynnika Trizol. Kolejne etapy procedury przeprowadzano zgodnie z instrukcją producenta:
    1. Powstałą mieszaninę ekstrahowano 0,2 ml chloroformu
    2. Po ekstrakcji fazę wodną strącano przez dodanie 0,5 ml izopropanolu
    3. Po odwirowaniu (12000 g, 10 min, 4°C) otrzymany osad RNA płukano 75 % alkoholem etylowym, suszono i rozpuszczano w 100 µl buforu TE
    4. Następnie RNA ponownie strącano (220 µl alkoholu etylowego 99,8 %, 10 µl octanu sodowego 3M, przez noc, -70°C), odwirowywano (12000 g, 10 min, 4°C), suszono i rozpuszczano w wodzie (20-100 µl)
Odczynniki:
  1. Bufor denaturujący
    1. 4M izotiocyjanek guanidyny
    2. 0.25 M cytrynian sodu
    3. 0.5% sarkozyl
    4. 0.1 M merkaptoetanol

Autor: dr Jadwiga Marchewka

Na podstawie: Usarek E, Gajewska B, Kaźmierczak B, Kuźma M, Dziewulska D, Barańczyk-Kuźma A. A study of glutathione S-transferase pi expression in central nervous system of subjects with amyotrophic lateral sclerosis using RNA extraction from formalin-fixed, paraffin-embedded material. Neurochem Res. 2005 Aug;30(8):1003-7.

Zapraszamy do dyskusji na ten temat na naszym forum http://metlab.pl/forum/topic57-izolacja-rna-z-tkanek-utrwalonych-w-parafinie-ffpe-formalinfixed-paraffinembedded.html