Izolacja białek komórkowych - lizaty komórkowe

1. Zwiruj komórki 1400 rmp 5 minut w temperaturze pokojowej
2. Przepłucz komórki 2 x zimnym PBS
3. Usuń delikatnie PBS i zawieś komórki w zimnym buforze lizującym (zawierającym świeżo dodane inhibitory proteaz i fosfataz). 1ml buforu/10 x 1 000 000 komórek rosnących w zawiesinie.
4. Inkubuj komórki w buforze lizujacym 30 minut na lodzie. Mieszaj komórki co 5 minut.
5. Zwiruj lizaty komórkowe 10 000 rpm przez 5 minut w 4°C w celu usunięcia niezlizowanych komórek oraz jąder komókowych.
6. Przenieś nadsącz do nowych probówek i oznacz w nim zawartość białka
Odczynniki:
bufor lizujący
1. 1 % NP40
2. 20 mM Tris-HCl (pH 7.4)
3. 150 mM NaCl
4. 5 mM NaF
5. 5 mM Sodium pyrophosphate
6. 5 mM EDTA
7. inhibitory proteaz i fosfataz muszą być dodane bezpośrednio przed doświadczeniem (1 mM PMSF, 10 ug/ml leupeptin, 1 mM ortowanadan sodu)

szczegółowe przygotowanie buforu lizującego:

Przygotuj stoki roztworów w następujący sposób:
1. 500mM Tris-hcl (pH7.4): 6.055g Trizma w 80ml wody destylowanej, doprowadź pH HCL-em do 7,4 i dopełnij woda destylowaną do 100ml
2. 1M NaCL: 5.844g NaCl w 100ml wody destylowanej
3. 100mM NaF: 0,4199g NaF w 100ml wody destylowanej
4. 100mM Sodium pyrophosphate: 4g NaPP w 100ml wody destylowanej
5. 100mM EDTA 3,72g EDTA w 80 ml wody destylowanej, doprowadź pH do 8.0 NaOH i dopełnij woda destylowaną do 100ml
6. 100mM EGTA: 3,8g EGTA w 80 ml wody destylowanej, doprowadź pH do 8.0 NaOH i dopełnij woda destylowaną do 100ml
7. 100mM PMSF: 0,174g PMSF w 10 ml etanolu, rozdozuj do probówek 0,5 ml przechowuj w -20°C
8. 1mg/ml leupeptyny: 1mg w 1ml wody destylowanej, rozdozuj do probówek 0,5 ml przechowuj w -20°C
9. 100mM ortowanadan sodu: 1,839 ortowanadanu sodu w 100 ml wody destylowanej, doprowadź pH do 10.0 NaOH lub HCL, gotuj roztwór do momentu odbarwienia (ok 10 minut), ochłodź roztwór, doprowadź ponownie pH do 10, czynność powtarzaj 3 razy, rozdokazuj ortowanadan i przechowuj w -20°C
Przygotuj bufor lizujący (100ml) poprzez zmieszanie buforów z przygotowanych stoków w następujący sposób:
1. 1ml NP40
2. 15ml 1M Na
3. 4 ml 500 mM Tris-HCL (pH 7,4)
4. 5 ml 100mM NaF
5. 5 ml 100 mM NaPP
6. 5 ml 100 mM EDTA
7. 5 ml 100mM EGTA
Przygotowany bufor przechowuj w 4°C. Przed użyciem buforu dodaj świeże inhibitory proteaz i fosfataz.

Autor: dr Joanna Skubis-Zegadło