Metoda Dot blot

Metoda dot blot jest podobna zasadą działania do metody western blotting (obie metody pozwalają na identyfikację i analizę białek). Jednak w metodzie dot blot białka nie są rozdzielane przy użyciu elektroforezy a bezpośrednio nanoszone na membranę a następnie wykrywane za pomocą przeciwciał.

1. Nanieś 2 ul próbki na membranę nitrocelulozowa lub PVD (pamiętaj, że membrana PVDF wymaga aktywacji metanolem)
2. Pozwól próbce wniknąć w membranę i inkubuj ją z roztworem blokującym (np. 5% mleko, 5% BSA) przez godzinę
3. inkubuj membranę z przeciwciałami pierwszorzędowymi w 1% roztworze blokującym przez 2 godziny w RT.
4. Wypłucz membranę 3-5 razy (PBST/ TBST) po 5-10 minut.
5. Inkubuj membranę z drugorzędowymi przeciwciałami przez godzinę w RT
6. Wypłucz membranę 3-5 razy (PBST/ TBST) po 5-10 minut.
7. Wywołaj reakcję z odczynnikami chemiluminescencyjnymi

Przejdź do: Przygotowanie odczynników chemiluminescencyjnych

Autor: dr Joanna Skubis-Zegadło