Metody

Kategoria: Metody

Tagi: białka chromatografia oczyszczanie przeciwciała

Data: 2008-11-14

Oczyszczanie przeciwciał metodą chromatografii powinowactwa.

Procedura oczyszczania przeciwciał metodą chromatografii powinowactwa obejmuje następujące etapy:

  1. Aktywacja złoża
  2. Przyłączenie ligandu (w tym wypadku specyficznego do przeciwciał antygenu) do kolumny
  3. Opłukanie niezwiązanego z kolumną ligandu i wysycenie pozostałych aktywnych miejsc na kolumnie
  4. Zrównoważenie kolumny, naniesienie surowicy i inkubacja kolumny z surowicą
  5. Odpłukanie niezwiązanych cząsteczek
  6. Elucja swoistych przeciwciał

Aktywacja złoża, wiązanie ligandu i wysycanie pozostałych aktywnych miejsc na kolumnie.

  1. Na kolumnę z odpowiednim złożem (np. agaroza, sefadex, ...) łączy się ligand poprzez grupy ~SH. Białko powinno zawierać więcej niż 50% wolnych grup SH. Jeśli jest mniej należy białko zredukować (np. MET) w celu zwiększenia zawartości wolnych grup SH.
  2. Wybrane złoże doprowadzić do temperatury pokojowej i zrównoważyć buforem, który będzie użyty do łączenia z ligandem (bufor do łączenia).
  3. Nanieść roztwór ligandu w buforze do łączenia. Używać około 1ml roztworu na 1ml żelu. Pozostawić niewielką ilość roztworu do pomiaru ilości białka.
  4. Inkubacja 15 minut w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem zawartości kolumny. Po czym inkubacja godzinę bez mieszania.
  5. Przemyć kolumnę buforem użytym do łączenia ligandu (około 3 objętościami kolumny). Wyciek z kolumny i ostatnie płukanie zachować do pomiaru białka.
  6. Zmierzyć ilość białka z punktu nr 2 (w celu sprawdzenia efektywności wiązania ligandu), 4 i 5 przy długości fali 280 nm.
  7. Nanieś bufor do wysycania kolumny na każdy 1 ml kolumny 1 ml buforu.
  8. 15 minut delikatnie mieszać zawartość kolumny w temperaturze pokojowej a następnie inkubować jeszcze godzinę w temperaturze pokojowej bez mieszania.
  9. Przemyć kolumnę buforem do przemywania (około 6 objętości kolumny) a następnie buforem do przechowywania kolumny (około 2 objętości kolumny).
  10. Przechować kolumnę związaną z ligandem w buforze do przechowywania kolumny w objętości około 2 ml buforu ponad złoże w temperaturze 4°C.

Oczyszczanie przeciwciał na kolumnie powinowactwa

  1. Kolumnę z antygenem związanym ze złożem oraz używane bufory doprowadzić do temperatury pokojowej w celu uniknięcia wnikania pęcherzyków powietrza w żel.
  2. Zrównoważyć kolumnę PBS (około 3 objętościami kolumny) lub innym buforem w którym rozpuszczona jest próba poddawana oczyszczaniu.
  3. Nanieść surowicę rozcieńczoną 1:1 PBS i inkubować godzinę w temperaturze pokojowej.
  4. Odpłukać PBS-em niezwiązane z kolumną białka (około 3 objetościami kolumny).
  5. Swoiste przeciwciała (związane z peptydami) eluować 0,1M roztworem glicyny o pH 2,4 (w jednomililitrowych frakcjach) do probówek zawirajacych 50µl 1M TRIS, pH9 lub 100 µl 1M Tris, pH 7.5 (neutralizacja niskiego pH buforu do elucji).
  6. Ilość białka w poszczególnych frakcjach mierzyć spektrofotometrycznie przy długości fali 280 nm.
  7. Otrzymane po oczyszczeniu frakcje zawierają przeciwciała skierowane przeciwko peptydom użytym do immunizacji zwierząt.
  8. Stężenie przeciwciał we frakcjach można obliczyć posługując się następującą proporcją: 1 OD280 = 0,75 mg/ml.

Regeneracja i przechowywanie kolumny:

  1. Przemyć kolumnę PBS jak najszybciej po zakończeniu eucji (około 8 objetosciami kolumny). (Szybkie przemycie kolumny jest ważne w celu ochrony, przez działaniem niskiego pH buforu elucyjnego na związany z kolumną ligand).
  2. Przemyć kolumnę buforem do przechowywania kolumny (około 4 objętościami kolumny).
  3. Nanieść około 2ml buforu do przechowywania kolumny na górę żelu i przechowywać kolumnę w temperaturze 4°C.
Odczynniki:
  1. bufor do łączenia ligandu
    1. 50 mM Tris
    2. 5mM EDTA-Na, pH 8,5
  2. bufor do wysycania kolumny
    1. 5050mM L-cysteina-HCL w buforze do łączenia ligandu
  3. bufor do przemywania kolumny
    1. 1M NaCl
    2. 50 mM Tris
  4. bufor do elucji z kolumny
    1. 0,1M roztwór glicyny o pH 2,4
  5. bufor do przechowywania kolumny
    1. PBS (0,1M KH2PO4, 0,1M Na2HPO4x7H2O, 0,15M NaCl)
    2. 0,05% NaN3

Przejdź do: chromatografia powinowactwa

Autor: dr Joanna Skubis-Zegadło

Zapraszamy do dyskusji na ten temat na naszym forum http://metlab.pl/forum/topic58-oczyszczanie-przeciwcial-metoda-chromatografii-powinowactwa.html