Otrzymywanie komórek kompetentnych i transformacja E. coli metodą rubidowo-wapniową (Kushner, 1978)

1. Hodowlę nocną bakterii odmłodzić w stosunku 1:50 i hodować do OD600 0,2 - 0,3
2. Wirować (15 min, 4000 rpm, 4°C), supernatant odlać, osad zawiesić w 1ml roztworu 1 i ponownie wirować w warunkach identycznych jak poprzednio
3. Po ostatnim, osad zawiesić w 200 ml tegoż samego roztworu i rozdzielić do probówek po 50 ml.Bakterie zamrozić w -70°C
4. Supernatant odlać, osad przemyć i zawiesić w 200 µl roztworu 2, a następnie zamrozić
5. Bakterie kompetentne rozmrażać z –70°C na lodzie
6. Dodać mieszaninę ligacyjną w ilości 20 µl i inkubować przez 30 min na lodzie
7. Następnie przenieść je do 43°C na 40 s, dodać 800 µl pożywki płynnej LB, ponownie przenieść na lód na 1 min a następnie inkubować w 37°C przez 1 godzinę
8. Po tym czasie zawiesinę komórkową wysiać na LB agar z dodatkiem odpowiedniego antybiotyku i inkubować przez noc w 37°C.

Autor: dr Agnieszka Sałamaszyńska-Guz