Metody

Kategoria: Metody

Tagi: bakterie DNA transfekcja

Data: 2009-07-31

Otrzymywanie komórek kompetentnych i transformacja E. coli metodą rubidowo-wapniową (Kushner, 1978)

  1. Hodowlę nocną bakterii odmłodzić w stosunku 1:50 i hodować do OD600 0,2 - 0,3
  2. Wirować (15 min, 4000 rpm, 4°C), supernatant odlać, osad zawiesić w 1ml roztworu 1 i ponownie wirować w warunkach identycznych jak poprzednio
  3. Po ostatnim, osad zawiesić w 200 ml tegoż samego roztworu i rozdzielić do probówek po 50 ml.Bakterie zamrozić w -70°C
  4. Supernatant odlać, osad przemyć i zawiesić w 200 µl roztworu 2, a następnie zamrozić
  5. Bakterie kompetentne rozmrażać z –70°C na lodzie
  6. Dodać mieszaninę ligacyjną w ilości 20 µl i inkubować przez 30 min na lodzie
  7. Następnie przenieść je do 43°C na 40 s, dodać 800 µl pożywki płynnej LB, ponownie przenieść na lód na 1 min a następnie inkubować w 37°C przez 1 godzinę
  8. Po tym czasie zawiesinę komórkową wysiać na LB agar z dodatkiem odpowiedniego antybiotyku i inkubować przez noc w 37°C.
Odczynniki:
  1. roztwór 1
    1. 10mM RbCl
    2. 10mM MOPS pH 7,0
  1. roztwór 2
    1. 10mM RbCl
    2. 50mM CaCl 2
    3. 100mM MOPS pH 6,5
    4. 15% glicerol

Autor: dr Agnieszka Sałamaszyńska-Guz

Zapraszamy do dyskusji na ten temat na naszym forum http://metlab.pl/forum/topic97-otrzymywanie-komorek-kompetentnych-i-transformacja-e-coli-metoda-rubidowowapniowa.html