Metody

Kategoria: Metody

Tagi: kwasy nukleinowe mitochondria PCR RNA

Data: 2008-12-15

Oznaczanie długości ogonów poli(A)

Mechanizm obróbki mitochondrialnych transkryptów w komórkach ssaczych powoduje tworzenie wolnej grupy hydroksylowej na końcu 3' oraz pojedynczej grupy fosforanowej na końcu 5' cząsteczki mRNA. Umożliwiło to oznaczenie długości ogonów poli(A) dołączonych do końca 3' cząsteczki mRNA przy użyciu techniki opierającej się na cyrkularyzacji cząsteczki RNA czyli ligacji jej końców 3' i 5'. Technika ta zwana skrótowo PATLA (ang. Poly(A) Tail Length Assay) umożliwia również jednoczesną analizę sekwencji końców 3' i 5' transkryptu. Zaletą opisanej techniki jest to, że poddana cyrkularyzacji cząsteczka RNA nie posiada wolnych końców 3' oraz 5'. Przez to jest niepodatna na działanie egzorybonukleaz, co zmniejsza możliwość powstania ewentualnych artefaktów. Ponadto analizowana długość ogona poli(A) nie zależy od miejsca przyłączania startera w reakcji odwrotnej transkrypcji, co jest wadą technik opartych na odwrotnej transkrypcji z użyciem starterów oligo(dT).

schemat techniki zastosowanej do okreslenia długości ogonów poli(A)

Rysunek: Schemat techniki zastosowanej do określenia długości ogonów poli(A) dla transkryptu ND3.

Rozdział w denaturującym żelu akrylamidowym

  1. Produkty PCR po reamplifikacji w drugiej reakcji PCR nanoszono na mocznikowo-formamidowy denaturujący żel poliakrylamidowy przygotowany według przepisu opisanego przez Litt i wsp. W tym celu odważano 16,5 g mocznika i dodawano do mieszaniny zawierającej 8,75 ml 40% roztworu akrylamid:bisakrylamid (37,5:1), 10 ml 5× TBE (0,45 M Tris, 10 mM EDTA pH 8,0, 0,45 M kwas borowy) i 16 ml formamidu. Mieszaninę akrylamidu ogrzewano w łaźni wodnej (37şC) do momentu rozpuszczenia mocznika i filtrowano przez filtr 45 µm. Żel wylewano w szybach o wymiarach 28 × 16,5 × 0,1 cm.
  2. W celu wylania stopki pobierano 3 ml mieszaniny akrylamidu i dodawano 34 µl APS (10% roztwór nadsiarczanu amonu) i 6,5 µl TEMED (N,N,N',N'-tetrametylenodiamina).
  3. Po spolimeryzowaniu stopki do 40 ml pozostałej mieszaniny akrylamidu dodawano 470 µl APS i 26 µl TEMED i wylewano właściwy żel denaturujący.
  4. Żel pozostawiano do polimeryzacji na ok. 5 godzin.
  5. Żel montowano w aparacie do elektroforezy, zalewano 1× TBE i dokładnie przemywano kieszonki w celu usunięcia resztek mocznika i formamidu. Po naniesieniu próbek elektroforezę prowadzono przez ok. 16 godzin przy napięciu 100V w 37°C.
  6. Po zakończonym rozdziale żel barwiono srebrem przy użyciu zestawu Silver Stain Kit (Kucharczyk). Wybarwiony żel skanowano.

Autor: dr Janusz Piechota

Zapraszamy do dyskusji na ten temat na naszym forum http://metlab.pl/forum/topic49-oznaczanie-dlugosci-ogonow-polia.html