Artykuły

Kategoria: Artykuły

Tagi: biologia molekularna kwasy nukleinowe RNA

Data: 2009-02-23

Oznaczanie jakości RNA bardzo ważny krok w badaniach molekularnych

Izolowanie RNA jest podstawowym etapem wielu metod molekularnej analizy. Pracując z RNA należy pamiętać o wielu czynnikach, które wpływają na jakość RNA min: kontaminacje RNazami, białkami, genomowym DNA czy degradacja cząsteczki związana np. z nieprawidłowym przechowywaniem materiału. Ponieważ jakość RNA ma bezpośredni wpływ na wynik eksperymentu należy bardzo solidnie i powtarzalnie oznaczać ją zaraz po wyizolowaniu RNA.
Jakość RNA ocenia się za pomocą kilku metod:

  1. Ocena gęstości optycznej w żelu
  2. Ocena spektroforetyczna
  3. Czipowa technika Bioanalyzer 2100

Ocena gęstości optycznej w żelu

Jedną z najstarszych metod stosowanych w laboratoriach jest oznaczanie stosunku podjednostek 28S do 18S po rozdziale próbki RNA w żelu agarozowym z bromkiem etydyny. Jeśli stosunek ten wynosi 2 i więcej RNA jest dobrej jakości.

Ocena spektrofotometryczna

Kolejną metodą szeroko stosowaną jest pomiar spektrofotometryczny wyizolowanego materiału przy różnych długościach fali: 240 nm (tło i możliwe kontaminacje), 260 nm (specyficzne dla kwasów nukleinowych), 280 nm (specyficzne dla białek), 320 nm (tło i możliwe kontaminacje). Na podstawie OD 260 nm odczytujemy ilość RNA natomiast stosunek OD 260/280 mówi nam o jakości a stosunek 260/240 nm lub 260/320 nm o czystości wyizolowanej próbki. Jeśli stosunek pomiarów przy długości fal: 260/280nm jest większy niż 1,8 to wynik jest akceptowany jako RNA o dobrej jakości. Jednak obecność genomowego DNA w próbce może podczas pomiaru OD 260 prowadzić do przeszacowania realnej ilości RNA. Trafność pomiaru stosunku OD 260/280 jest również kwestionowana ponieważ odpowiada on tylko 40% zawartości RNA i może zawierać zanieczyszczenia białkowe.

Bardziej specyficznym spektroforetycznym pomiarem jest użycie odpowiednich sond znakujących np. RNA RiboGreen dye. Użycie sond pozwala wykryć już 1ng RNA/ml i w przeciwieństwie do poprzedniej metody jest bardziej specyficzna i nie oznacza ewentualnych zanieczyszczeń białkami i DNA.

Czipowa technika Bioanalyzer 2100

Jedną z nowszych metod jest określanie integralnośći RNA jako liczby od 1-10 w zależności od jakości badanej próbki. Pomiaru dokonuje się w urządzeniu Agilent 2100, którego podstawę działania stanowi połączenie, elektroforezy mikrokapilarnej, mikropłynów, mikroczipów i detekcji fluorescencyjnej. Pomiar odbywa się automatycznie i wymaga niewielkich ilości badanego materiału już od 200 pg RNA. Program pozwala na określenie całościowego RNA w systemie numerowym od 1-10 gdzie 1 oznacza RNA najbardziej zdegradowane a 10 najlepszej jakości. Wynik otrzymujemy w postaci wykresu:

wynik badania jakosci RNA

Rysunek:Przykładowe wyniki dla dwóch niezależnych próbek.

Autor: dr Joanna Skubis-Zegadło

Na podstawie: "The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements" Andreas Schroeder, Odilo Mueller, Susanne Stocker,Ruediger Salowsky, Michael Leiber, Marcus Gassmann, Samar Lightfoot,Wolfram Menzel, Martin Granzow and Thomas Ragg, BMC Molecular Biology 2006,7:3;
"RNA integrity and the effect on the real-time qRT-PCR performance"Simone Fleige, Michael W. Pfaffl, Molecular Aspects of Medicine 27 (2006) 126–139

Zapraszamy do dyskusji na ten temat na naszym forum http://metlab.pl/forum/topic69-oznaczanie-jakosci-rna-bardzo-wazny-krok-w-badaniach-molekularnych.html