Metody

Kategoria: Metody

Tagi: in vitro linie komórkowe

Data: 2009-02-20

Oznaczanie żywotności komórek metodą MTT

Zasada testu opiera się na reakcji, która zachodzi w żywych komórkach i polega na redukcji żółtego rozpuszczalnego bromku 3-(4,5-dimethylo-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium (MTT) do błękitnego formazanu. Komórki wysiewa się na płytkę 96-dołkową i po ich inkubacji z badanymi związkami dodaje się MTT. Ponieważ żywe komórki powodują redukcję MTT do farmazanu więc im więcej jest żywych komórek tym większa jest gęstość optyczna.

  1. Komórki w fazie logarytmicznego wzrostu w gęstości ok. 10 000 komórek na dołek (zależy od rodzaju komórek i czsu inkubacji -na 24h wysiać ok. 5 000 komórek na 72h - 2500), wysiać na 96-dołkową płytkę w objetosci np. 100 µl
  2. Inkubować komórki około 12 godzin w temperaturze 37°C z 5% stężeniem CO2
  3. Dodać badane związki w objętości np. 10 µl i prowadzić inkubację w 37°C z 5% stężeniem CO2 w zależności od układu doświadczenia przez 6, 12, 24, 48, 72 godzin
  4. Nanieść 100 µl roztworu MTT w PBS na każdy dołek by końcowe stężenie wynosiło 0.5-1 mg/ml, następnie kontynuować inkubację przez kolejne 4 godziny
  5. Odstukać pożywkę na ręcznikach papierowych
  6. Wytrącony formazan rozpuścić w 100 µl DMSO. Wymieszać płytki i usunąć bąbelki powietrza
  7. Odczytywać gęstość optyczną przy długości fali 570 nm za pomocą czytnika płytek
  8. Z otrzymanych danych wyliczyć % zahamowania wzrostu komórek w obecności badanego związku, przyjmując absorpcję roztworu komórek kontrolnych za 100 %.

Autor: dr Magdalena Kowalczyk

Zapraszamy do dyskusji na ten temat na naszym forum http://metlab.pl/forum/topic48-oznaczanie-zywotnosci-komorek-metoda-mtt.html