Metody

Kategoria: Metody

Tagi: biologia molekularna kwasy nukleinowe PCR RNA

Data: 2009-03-05

PCR w czasie rzeczywistym

Przygotowanie RNA wolnego od zanieczyszczeń DNA

  1. 5 µg RNA zmieszać z 10 jednostkami inhibitora rybonukleaz (Fermentas), 1 jednostką deoksyrybonukleazy I wolnej od RNAz (Fermentas), 1 µl buforu do reakcji (100 mM Tris-HCl, 25 mM MgCl2, 1 mM CaCl2) oraz wodą do końcowej objętości 10 µl
  2. Mieszaninę reakcyjną inkubować 30-60 minut w 37°C. Reakcję zatrzymać poprzez dodanie 1 µl 25 mM EDTA i ogrzanie (10 min, 65°C)

Próbki RNA testowano na obecność pozostałości DNA w reakcji PCR stosując startery komplementarne do genu ß-2-mikroglobuliny (30 cykli denaturacji (15s, 95°C), przyłączania starterów (30 s, 59°C) i syntezy (30 s, 72°C)). Do reakcji PCR brano 1 µl oczyszczonego RNA.

Odwrotna transkrypcja ze starterem oligo(dT)18

Odwrotną transkrypcję wykonywano przy użyciu zestawu Omniscript RT Kit (Qiagen) oraz startera oligo(dT)18 według wskazówek producenta:

  1. zmieszano 1 µl buforu do reakcji RT, 1 µl Mix dNTP (0.5 mM każdego z dNTP), 1 µl startera oligo(dT)18 (10 µM), 10 jednostek (0,25 µl) inhibitora rybonukleaz (Fermentas), 2 jednostki (0,5 µl) odwrotnej transkryptazy Omniscript, 4,25 µl wody i 1 µg (2 µl) RNA wolnego od zanieczyszczeń DNA. Mieszaninę reakcyjną inkubowano 60 min w 37°C
  2. Reakcję zatrzymywano poprzez ogrzanie (5 min, 93°C) i natychmiastowe schłodzenie w lodzie
  3. Jakość cDNA sprawdzano w reakcji PCR stosując startery komplementarne do genu ß- 2- mikroglobuliny.

Reakcja PCR z użyciem zestawu QuantiTect® SYBR® Green PCR (Qiagen)

Reakcję PCR w czasie rzeczywistym wykonywano w urządzeniu LightCycler (Roche). Skład mieszaniny reakcyjnej był następujący:

  1. 10 µl miksu QuantiTect® SYBR® Green PCR Master Mix, po 2 µl starterów P i L o stężeniu 5 µM, 0,5-1,5 µl otrzymanego cDNA i woda mQ do końcowej objętości 20 µl
  2. Reakcja PCR składała się z etapu wstępnej denaturacji i aktywacji polimerazy DNA (15 min, 95°C) oraz 35 cykli denaturacji (5 s, 95°C), przyłączenia starterów (30 s, 55-59°C w zależności od użytej pary starterów) oraz syntezy (72°C, 15-25 s w zależności od użytej pary starterów)
  3. Po reakcji wykonywano krzywą topnienia celem sprawdzenia jakości otrzymanych produktów PCR. W celu sporządzenia krzywej kalibracyjnej wykonywano 3 reakcje PCR z 20, 40 i 80 ng totalnego DNA wyizolowanego zestawem DNA Tissue Kit (Qiagen).

Reakcja PCR z użyciem polimerazy Taq (Fermentas)oraz barwnika SYBR® Green I (Sigma).

Skład mieszaniny reakcyjnej:

  1. 2 µl buforu do reakcji z (NH3)2SO4 (750 mM Tris-HCl (pH 8,8), 200 mM (NH4)2SO4, 0,1% Tween 20), 2 µl 25 mM MgCl2, 1,5 µl Mix dNTP (każdy dNTP w stężeniu 2 mM), 2 µl starterów P i L o stężeniu 5 µM, 2 jednostki (2 µl) polimerazy Taq, 0,5-1,5 µl cDNA, woda mQ do końcowej objętości 20 µl. Bufor do reakcji ponadto zawierał barwnik SYBR® Green I w ilości 0,25 µl barwnika na 1 ml buforu.
  2. Bufor po dodaniu barwnika przetrzymywano w 4şC przez okres nie dłuższy niż 2 miesiące.
  3. Pozostałe warunki reakcji były podobne jak w przypadku reakcji PCR z użyciem zestawu QuantiTect SYBR Green PCR (Qiagen) z tą różnicą, że czas wstępnej denaturacji skrócono do 1 minuty, a szybkość wzrostu temperatury w czasie reakcji zmniejszono do 2°C/min.

Autor: dr Janusz Piechota

Zapraszamy do dyskusji na ten temat na naszym forum http://metlab.pl/forum/topic35-pcr-w-czasie-rzeczywistym.html