Metody

Kategoria: Metody

Tagi: in vitro linie komórkowe mitochondria

Data: 2009-02-20

Pomiar aktywności syntazy cytrynianowej oraz oksydazy cytochromu c

Przygotowanie frakcji komórek wzbogaconej w mitochondria

  1. 5 × 1 000 000 komórek przepłukanych dwukrotnie roztworem PBS zawieszano w 400 µl schłodzonego buforu A
  2. Do komórek dodawano 400 µl schłodzonego roztworu digitoniny (0,2 mg/ml w buforze A)
  3. Komórki inkubowano 5 minut w lodzie i wirowano (5000 × g, 3 min). Supernatant odrzucano a osad zawieszano w 600 µl buforu B i inkubowano w lodzie 5 minut
  4. Komórki wirowano (10000 × g, 3 min), supernatant odrzucano, a osad komórek zamrażano w -80°C
  5. Po rozmrożeniu osad komórek zawieszano w 200 µl 10 mM buforu fosforanowego pH 7,4
  6. Zawiesinę komórek trzykrotnie zamrażano w ciekłym azocie i rozmrażano w łaźni wodnej 37°C. Następnie mierzono stężenie białka. Zawiesinę komórek trzymano w lodzie do czasu pomiaru aktywności enzymatycznej.
Odczynniki:
  1. Bufor A
    1. 20 mM MOPS-KOH pH 7,4
    2. 250 mM sacharoza
  1. Bufor B
    1. 20 mM MOPS-KOH pH 7,4
    2. 250 mM sacharoza
    3. 1 mM EDTA pH 8,0

Pomiar aktywności syntazy cytrynianowej

Pomiar aktywności opierał się na metodzie kolorymetrycznej. Zawiesinę komórek dodawano do mieszaniny reakcyjnej zawierającej 5,5’-ditiobis(kwas 2-nitrobenzoesowy (DTNB) oraz substraty dla syntazy cytrynianowej: szczawiooctan i acetylo-CoA. Powstający w reakcji CoA-SH reagował z DTNB tworząc w wyniku szeregu reakcji związek TNB (kwas 2-nitro-5-tiobenzoesowy) o żółtej barwie.

  1. Do kuwety 0,5 ml odmierzano 35 µl buforu Tris-HCl (750 mM, pH 8,0), 35 µl DTNB (1 mM roztwór w 128,5 mM buforze Tris-HCl pH 8,0), 7 µl Tritonu X, 17,5 µl 8 mM acetylo-CoA, 228 µl wody mQ oraz 10 µl zawiesiny komórek
  2. Do komórek dodawano 400 µl schłodzonego roztworu digitoniny (0,2 mg/ml w buforze A)
  3. Po inkubacji przez 1 minutę do kuwety dodawano 17,5 µl 10 mM szczawiooctanu i mierzono wzrost poziomu absorbancji przy długości fali=412 nm.
  4. Pomiar prowadzono przez 4 minuty dokonując odczytu co 30 s.
  5. Po rozmrożeniu osad komórek zawieszano w 200 µl 10 mM buforu fosforanowego pH 7,4
  6. Zawiesinę komórek trzykrotnie zamrażano w ciekłym azocie i rozmrażano w łaźni wodnej 37°C. Następnie mierzono stężenie białka. Zawiesinę komórek trzymano w lodzie do czasu pomiaru aktywności enzymatycznej.
wzór na pomiar aktywności enzymatycznej

gdzie:
VK - objętość reakcji (350 µl), VD - objętość dodanej zawiesiny komórek (10 µl), l - długość drogi optycznej (1 cm), CB - stężenie białka w próbce (mg/ml), TNB=13,8 mM-1 · cm-1.

Pomiar aktywności oksydazy cytochromu c

Pomiaru aktywności oksydazy cytochromu c dokonywano metodą kolorymetryczną z wykorzystaniem zredukowanego cytochromu c. Cytochrom c ulegając utlenieniu w wyniku reakcji z oksydazą cytochromu c zmienia swoje widmo absorpcji. Zmiany obserwowano przy długości fali=550 nm.

Zredukowany cytochrom c przygotowano przez dodanie 0,5 µl 5% tiosiarczanu sodu na każde 100 µl roztworu cytochromu c. Roztwór cytochromu c w 10 mM buforze fosforanowym pH 7,0 sporządzano w stężeniu 10 mg/ml. Stopień zredukowania cytochromu c mierzono spektrofotometrycznie. Do kuwety dodawano 100 µl 100 mM buforu fosforanowego (pH 7,0), 100 µl zredukowanego cytochromu c i 800 µl wody. Absorbancja przy ?=550 nm wahała się z granicach 1,9- 2,1. Zredukowany cytochrom c przetrzymywano w lodzie.

  1. Do kuwety 1 ml odmierzano 100 µl buforu fosforanowego (100 mM, pH 7,0), 100 µl BSA (roztwór 10 mg/ml w 10 mM EDTA pH 8,0), 100 µl zredukowanego cytochromu c oraz 650 µl wody mQ.
  2. Po dodaniu 50 µl zawiesiny komórek mierzono spadek poziomu absorbancji przy ?=550 nm. Pomiar prowadzono przez 4 minuty dokonując odczytu co 30 s
  3. Z otrzymanych punktów czasowych liczono współczynnik regresji liniowej, który był miarą szybkości zmiany absorbancji w czasie A412/min. Specyficzną aktywność oksydazy cytochromu c ACOX wyrażoną jako nmol • min-1 • mg białka-1 obliczano ze wzoru:
wzór na specyficzną aktywność oksydazy cytochromu c

gdzie:
VK – objętość reakcji (1000 µl), VD – objętość dodanej zawiesiny komórek (50 µl), l – długość drogi optycznej (1 cm), CB – stężenie białka w próbce (mg/ml), Cyt. c=21 mM-1 • cm-1.

Autor: dr Janusz Piechota

Zapraszamy do dyskusji na ten temat na naszym forum http://metlab.pl/forum/topic51-pomiar-aktywnosci-syntazy-cytrynianowej-oraz-oksydazy-cytochromu-c.html