Metody

Kategoria: Metody

Tagi: białka in vitro linie komórkowe

Data: 2008-12-05

Pomiar szybkości glikolizy oraz potencjału oksydoredukcyjnego

Przebieg doświadczenia

10 000 000 komórek HeLa lub Jurkat po dwukrotnym przepłukaniu roztworem PBS zawieszano w 1 ml roztworu PBS i umieszczano w inkubatorze na 15 minut. Następnie komórki zwirowywano (5 min, 1200 obr./min), zawieszano w 1,5 ml 25 mM roztworu glukozy w PBS i umieszczano w inkubatorze na 1 godzinę. Zawiesinę komórek mieszano przez lekkie wstrząsanie co 10 minut, aby zapobiec opadaniu komórek na dno probówki. Następnie komórki zwirowywano (5 min, 5000 obr./min). Supernatant przenoszono do nowej probówki i przeznaczano do oznaczenia poziomu mleczanu i pirogronianu. Osad komórek zawieszano w 200 µl roztworu PBS i przeznaczano do pomiaru ilości białka w próbkach.

Pomiar stężenia mleczanu

Pomiar stężenia mleczanu wykonano metodą kolorymetryczną przy użyciu zestawu Lactate Reagent (Sigma). Metoda ta opiera się na sprzężeniu dwóch reakcji enzymatycznych. W pierwszej reakcji mleczan jest przekształcany do pirogronianu z powstaniem H2O2. W obecności H2O2 peroksydaza katalizuje oksydacyjną kondensację chromogennych prekursorów, co prowadzi do powstania barwnego produktu z maksimum absorpcji przy 540 nm.

Pomiar stężenia przebiegał w następujący sposób: do 98 µl roztworu odczynnika Lactate Reagent dodawano 2 µl supernatantu. Po odczekaniu 1 minuty dokonywano pomiaru absorbancji A540 przy długości fali=540 nm. Stężenie mleczanu CM obliczano ze wzoru:

wzOr na obliczenie stężenia mleczanu

gdzie: VK = objętość końcowa (100 µl), VD - objętość dodanego supernatantu (2 µl), l - długość optyczna (1 cm), CHROM - milimolowy współczynniki absorpcji obliczony na podstawie współczynnika regresji liniowej ze sporządzonej krzywej kalibracyjnej (CHROM = 11,5 mM-1 · cm-1).

Pomiar stężenia pirogronianu

Pomiar stężenia pirogronianu wykonano przy użyciu metody spektrofotometrycznej z zastosowaniem dehydrogenazy mleczanowej, która w pH 7 i nieco niższym redukuje pirogronian do mleczanu. Donorem elektronów jest NADH ulegający utlenieniu do NAD+. W widmie absorpcji NADH występuje pasmo absorpcyjne przy 340 nm, którego brak NAD+. Metoda pomiaru opierała się na pomiarze spadku absorpcji mieszaniny reakcyjnej przy długości fali=340 nm. Skład mieszaniny reakcyjnej był następujący: 70 µl supernatantu, 3 µl 5 mM NADH, 10 µl 0,7 M buforu fosforanowego pH 6,6, 5 µl roztworu dehydrogenazy mleczanowej (0,45 jednostki), 12 µl wody mQ. Próbą odniesienia była mieszanina reakcyjna, w której supernatant zastąpiono wodą mQ. Stężenie pirogronianu CP obliczano ze wzoru:

wzór na obliczenie stężenia pirogronianu

gdzie: DeltaA340 - zmiana absorbancji przy długości fali=340 nm, VK = objętość końcowa (100 µl), VD - objętość dodanego supernatantu (70 µl), l - długość optyczna (1 cm), NADH - milimolowy współczynnik absorpcji obliczony na podstawie współczynnika regresji liniowej ze sporządzonej krzywej kalibracyjnej (NADH = 6,09 mM-1 cm-1).

Szybkość glikolizy

Szybkość glikolizy określano ilością mmoli mleczanu wydzielonego przez komórki do supernatantu na godzinę na mg białka komórek. Metoda opiera się na obserwacji, że w hodowli w pożywce o wysokiej zawartości glukozy tylko niewielka część powstającego pirogronianu jest kierowana do cyklu Krebsa. Większość natomiast ulega redukcji do mleczanu w reakcji katalizowanej przez dehydrogenazę mleczanową. Komórka w ten sposób odzyskuje pulę NAD+ zużytego we wcześniejszych etapach glikolizy. Powstały w procesie glikolizy pirogronian i mleczan jest wydzielany poza komórkę.

Autor: dr Janusz Piechota

Zapraszamy do dyskusji na ten temat na naszym forum http://metlab.pl/forum/topic52-pomiar-szybkosci-glikolizy-oraz-potencjalu-oksydoredukcyjnego.html