Metody

Immunoprecypitacja białek (IP)

Reakcję immunoprecypitacji przeprowadza się zwykle 1,5 ml probówkach zawierających ok 0,5-1,00 ml lizatu komórkowego

  1. Przygotuj lizaty komórkowe w buforze zawierającym detergent (np. 1% NP40 lub 1% Triton X-100) oraz inhibitory proteaz. Im więcej komórek posłuży do przygotowania lizatów tym więcej białka będą zawierały lizaty (komórki adherętne: butelka T-25cm wystarcza do sporządzenia 1-2 reakcji immunoprecypitacji. Komórki rosnące w zawiesinie: 5 x 10 000 000 wystarcza do jednej precypitacji.)
  2. Przygotuj białko G lub A (związane ze złożem np. agarozą) poprzez 2 krotne przepłukanie zimnym PBS i inkubację z jednakową objętością 5% BSA w PBS 2 godziny w 4°C z mieszaniem. Na przeprowadzenie jednej immunoprecypitacji potrzebujesz 20 ul białka A/G (10ul etap wstępnego czyszczenia lizatów + 10ul strącanie kompleksów białko-przeciwciało)
  3. Czyszczenie wstępne lizatów komórkowych (usunięcie cząsteczek, które mogłyby niespecyficznie reagować z bialskim A/G) dodaj 10ul przepłukanego białka A/G do 0,5 ml lizatow i inkubuj 1-2 godzin w 4°C z delikatnym mieszaniem
  4. Usuń białko A/G poprzez wirowanie 10,000 rpm, 1 min, 4°C.
  5. Przenieś lizaty do świeżej probówki i dodaj przeciwciała. Inkubuj mieszaninę godzinę w 4°C z mieszaniem. Stężenie przeciwciał musi być dobrane eksperymentalnie należy zacząć od 1ul - 10ul przeciwciał na reakcje. Zawsze dołącz również kontrole do lizatów np. pomiń przeciwciało (inkubuj tylko złoże-białkoA/G z lizatami), lub dodaj do lizatow inne nie specyficzne (do badanego białka) przeciwciało (kontrolne przeciwciało + złoże-białko A/G)
  6. Dodaj 10 ul przepłukanego białka A/G-agaroza na 0.5 ml lizatu i inkubuj noc z mieszaniem w 4°C.
  7. W celu usunięcia niezwiązanych białek zwiruj próbki 3,000 rpm, 1 min, 4°C. Usuń nadsącz.
  8. Przepłakuj 3 razy kompleksy związane z białkiem A/G buforem do lizy komórek zawierającym inhibitory proteaz (dodaj bufor a następnie zwiruj próbki 3,000 rpm, 1 min, 4°C usuń nadsącz)
  9. Kompleksy z białkiem A/G (10ul) zawieś W 20 ul buforu Laemmli'ego i inkubuj 5 min w 100°C. Przeciwciała połączone z białkiem zostaną odłączane od białka A/G i złoża agarozowego.
  10. Usuń złoże poprzez wirowanie 10,000 rpm, 1 min, 4°C a nadsącz przenieś na żel SDS-PAGE i przeprowadź elektroforezę.
    1. Odczynniki:
      1. Bufor Laemmli'ego
        1. 4% SDS
        2. 20% glicerol
        3. 120 mM Tris-HCl pH 6,4
        4. bromofenol blue (dodawać kroplami dla uzyskania odpowiedniego granatowego koloru)
      2. Autor: dr Joanna Skubis-Zegadło

Zapraszamy do dyskusji na ten temat na naszym forum http://metlab.pl/forum/topic91-przepis-na-immunoprecypitacje-bialek-ip.html