Artykuły


Stabilność RNA a sposób przechowywania tkanek

Wiele metod bazujących na pracy z RNA wymaga dobrej jakości pozyskanego materiału. Sposób przechowywania tkanek ma istotny wpływ na jakość RNA.

Tkanki utrwalone w formalinie zatopione w parafinowych bloczkach

Większość zakładów patologii przechowuje próbki pobranych podczas operacji ludzkich tkanek w parafinowych bloczkach. Materiał zatopiony w parafinowych bloczkach stosowany jest w rutynowych badaniach histopatologicznych coraz częściej materiał ten jest również używany do badań molekularnych.

Niewątpliwą zaletą pracy z parafinowymi bloczkami jest szeroki dostęp do materiału z odległych nawet lat, łatwy dostęp do podstawowych danych klinicznych pacjentów oraz najczęściej pełne rozpoznanie histopatologiczne. Zasadniczym problemem pracy z parafinowymi bloczkami jest natomiast stosunkowo słaba jakość wyizolowanego RNA.RNA pozyskiwane z tak przechowywanych tkanek jest w znacznym stopniu chemicznie zmodyfikowane, zdegradowane oraz charakteryzuje się występowaniem wiązań krzyżowych z białkami. Powyższe ograniczenia znacząco utrudniają izolację oraz ilościową i jakościową analizę RNA.

Tkanki, przed zatopieniem w parafinowych bloczkach, poddawane są procesowi utrwalania w formalinie (5% roztwór formaldehydu w wodzie). Na tym etapie następuje już częściowa degradacja RNA. Formaldehyd reaguje z zasadami azotowymi zawartymi w RNA lub DNA. Reakcja ta jest dwustopniowa: pierwszym etapem jest tworzenie N-metylolu, a następnie następuje stabilizacja mostka metylolowego między zasadami azotowymi.

Modyfikacja nukleotydów poprzez addycję metylolu, która zakłóca syntezę cDNA, jest na szczęście reakcją częściowo odwracalną. Godzinna inkubacja RNA z 10mM buforem TE (pH 7.0) w temperaturze 70°C powoduje usuwanie pochodnych metylolu. Częściową poprawę jakości RNA można również uzyskać poprzez inkubację RNA w buforze cytrynianowym o pH 3-6,5. Najlepsze wyniki uzyskano stosując 30-60 minutową inkubację RNA w buforze cytrynianowym o pH 4.0 w temperaturze 70°C. Usunięcie chemicznych modyfikacji RNA/DNA oraz stosowanie specjalnie do tego celu zaprojektowanych krótszych starterów (tak aby produkt reakcji był nie większy niż 200 par zasad) są niezbędnymi warunkami satysfakcjonującej pracy z materiałem utrwalonym w parafinie.

Tkanki utrwalone w formalinie zatopione w parafinowych bloczkach

Zaletą świeżych tkanek jest stosunkowo dobra jakość wyizolowanego z nich RNA. Duże znaczenie dla dobrej jakości RNA ma czas który upłynął od momentu pozyskania tkanki do momentu odpowiedniego zabezpieczenia jej. Choć niektóre dane mówią, że RNA w świeżych tkankach jest stabilne nawet do 6 godzin w temperaturze pokojowej to jednak niewłaściwe przechowywanie niekorzystnie wpływa na ekspresję genów. Badana ekspresja wybranych genów zasadniczo różni się w zależności od czasu i sposobu przechowywania. Wydaje się, że najbardziej wiarygodne dane pochodzą z próbek gdzie tkanka w momencie pozyskania została przeniesiona na lód, lub umieszczona w specjalnym komercyjnie dostępnym płynie do przechowywania tkanek. Gorsze wyniki uzyskano gdy tkanki przechowywane były w temperaturze pokojowej lub w roztworze soli fizjologicznej w temperaturze pokojowej.

Autor: dr Joanna Skubis-Zegadło

Na podstawie:
Kiyohiro H, Hidetaka E, et all “Improved RT-PCR Amplification for Molecular Analyses with Long-term Preserved Formalin-fixed, Paraffin-embedded Tissue Specimens” Volume 54(7): 773–780, 2006 J. of Histochemistry & Cytochemistry I
Patrick M, Mitsuhiro O, et all “Biobanking of fresh frozen tissue: RNA is stable in nonfixed surgical specimens” Laboratory Investigation (2006) 86, 202–211.

Zapraszamy do dyskusji na ten temat na naszym forum http://metlab.pl/forum/topic60-stabilnosc-rna-a-sposob-przechowywania-tkanek.html