Metody

Kategoria: Metody

Tagi: białka biochemia biotechnologia precypitacja

Data: 2010-02-15

Strącanie (precypitacja) białek acetonem.

  1. Do strącania białek używaj określoną ilość lizatów komórkowych (np. 50 ug białka lub odpowiadającą mu ilość komórek w buforze do lizy komórek) i dodaj co najmniej 5 objętości lodowo-zimnego acetonu.
  2. Inkubuj probówki do 30 minut w temperaturze -20ºC (odwracaj probówki co 5 minut).
  3. Zwiruj probówki 15000 obrotów/minutę przez 5 minut w temperaturze 4ºC.
  4. Odrzuć supernatant i pozostaw probówki do wyschnięcia (około jedna minuta).
  5. Ponownie zawieś wytrącone białka (biały osad) w buforze SB i inkubuj probówki przez 5 minut w 100ºC. Próbki mogą być analizowane elektroforetyczne (SDS-PAGE) natychmiast lub być przechowywać w temperaturze -20ºC.

UWAGA: Zazwyczaj pelet powstały z 50ug białek ponownie zawiesza się w 20ul buforu SB. 50ug białka to ilość wystarczająca do rozdziału elektroforetycznego i detekcji z Coomassie lub reakcji z przeciwciałami.

Odczynniki:
  1. bufor SB 1x
    1. 1.51 g Trizma
    2. 20 ml Glicerol
    3. 35 ml dH20
    doprowadź HCL pH do 6,8 i dodaj:
    1. 4g SDS (proszek)
    2. 10 ml beta-Mercaptoethanolu
    3. 0.002g bromofenolu blue
    dopełnij woda do 200 ml, rozdozuj (po 1 ml) i przechowuj w -20ºC.

Autor: dr Joanna Skubis-Zegadło

Zapraszamy do dyskusji na ten temat na naszym forum http://metlab.pl/forum/topic108-stracanie-precypitacja-bialek-acetonem.html