Metody

Kategoria: Metody

Tagi: białka immunodetekcja przeciwciała

Data: 2009-02-23

Transfer białek na membranę i immunodetekcja białek

Transfer białek na membranę

Rozdzielone elektroforetycznie białka przenosi się na błonę wiążącą białka np. nitrocelulozową lub z fluorku poliwinylidenu (PVDF). Transfer ten ma na celu lepszą identyfikację cząsteczek technikami immunobarwienia oraz ułatwienie pracy ponieważ membrana jest bardziej odporna na uszkodzenia mechaniczne niż żel.

Elektrotransfer polega na przeniesieniu ujemnie naładowanych białek z żelu na membranę, pod wpływem przyłożonego napięcia prądu. Białka migrują w kierunku dodatniej elektrody i zostają zatrzymane na membranie umieszczonej za żelem co przedstawiono na rysunku poniżej.

Schemat elektroblottingu

Rysunek:Schemat elektroblottingu.

Białka, w postaci rozdzielonych prążków na różnych poziomach, są precyzyjnie przeniesione na membranę dając lustrzany obraz rozdzielonych w żelu polipeptydów.

Podczas elektrotransferu generowana jest spora ilość ciepła, które trzeba odprowadzić na zewnątrz. Dlatego najlepiej prowadzić transfer w chłodniach lub pojemnikach z lodem.
Transfer elektroforetyczny prowadzi się zwykle przez 2 godziny przy napięciu 100V. Zbyt krótki czas może spowodować niecałkowite przeniesienie białek zwłaszcza tych o większej masie. Zbyt długo prowadzony transfer powoduje przeniesienie białek poza membranę czyli ich utratę.

Przepis

  1. Żel po elektroforezie inkubować przez około 10 min w buforze do blokingu
  2. Przygotować odpowiedniej wielkości: membranę i bibułę (Whatman), namoczyć je w buforze do blottingu.
  3. Membranę z fluorku poliwinylidenu (PVDF) należy aktywować poprzez 10 minutową inkubacje w metanolu. Następnie opłukać wodą i inkubować w buforze do blokingu. Membrane nitrocelulozową namoczyć w buforze do blokingu.
  4. Ułożyć kanapkę według podanego na rysunku poniżej schematu. Należy uważać aby nie pozostawić bąbelków powietrza pomiędzy żelem a membraną i nie pomylić kolejności warstw.
  5. Blotting prowadzić 2 godziny przy napięciu 100V.
schemat warstw elektroblottingu

Rysunek:Schemat warstw w elektroblottingu.

Odczynniki:
  1. bufor do blottingu
    1. 39 mM glicyna
    2. 48 mM Tris
    3. 0,03% SDS
    4. 20% metanol
    5. woda destylowana

Immunodetekcja białek

Membranę z przeniesionymi na nią białkami należy wysycić w celu zablokowania miejsc niespecyficznego wiązania przeciwciał. Najczęściej stosowanym roztworem wysycającym jest 5% odtłuszczone mleko w TBST. Innym roztworem jest alkohol poliwinylowy lub gotowe roztwory oferowane przez firmy biotechnologiczne.
Wysycaną w ten sposób błonę inkubuje się z przeciwciałem pierwszorzędowym mającym wysokie powinowactwo do badanego białka.

schemat membrany po inkubacji z przeciwciałem pierwszorzędowym

Rysunek:Schemat: membrana po inkubacji z przeciwciałem pierwszorzędowym.

Po odpłukaniu nadmiaru przeciwciał membranę inkubuje się z przeciwciałem drugorzędowym, mającym powinowactwo do globuliny zwierzęcia z którego pochodzi przeciwciało pierwszorzędowe.

schemat membrany po inkubacji z przeciwciałem pierwszo i drugorzędowym

Rysunek:Schemat: membrana po inkubacji z przeciwciałem pierwszo i drugorzedowym.

Przeciwciało drugorzędowe zwiąne jest z enzymem (HRP, AP), który po dodaniu odpowiedniego substratu powoduje reakcje barwną co przedstwiono na schemacie poniżej.

Immunodetekcja białek

Rysunek:Schemat: Immunodetekcja białek

Przepis

  1. Membranę po zakończonym transferze należy opłukać wodą destylowaną
  2. Inkubować z roztworem wysycającym od 1godziny w temperaturze pokojowej do nocy w chłodni w zależności od potrzeb
  3. Inkubować z roztworem przeciwciał pierwszorzędowych w TBST lub roztworze 1% mleka w TBST. Czas w zależności od potrzeb od godziny w temperaturze pokojowej do nocy w 4°C z mieszaniem.
  4. Płukać 6-10 razy po 5 min w TBST.
  5. Inkubować z roztworem drugorzędowych przeciwciał w TBST. Czas 1-2 godzin w temperaturze pokojowej.
  6. Płukać 6-10 razy po 5 min w TBST.
  7. Detekcja białek odczynnikami chemiluminescencyjnymi: Przygotować roztwór odczynników do chemiluminescencji.
  8. Membranę zawinąć w folię (włożyć w koszulkę foliową). Usunąć bąble powietrza
  9. Przyłożyć kliszę i wywołać ją odczynnikami do wywoływania klisz

Odczynniki:

Odczynniki:
  1. bufor wysycający
    1. Roztwur 5% odtłuszczonego mleka w TBST
  2. TBST
    1. 3g Tris
    2. 8g NaCL
    3. 0.2g KCl
    4. 2ml Tween 20
    5. Dopełnić woda destylowaną do 1L i doprowadzić pH 7.6

Reakcja z przeciwciałami biotynylowanymi

Bardziej czułym systemem jest wykorzystanie przeciwciał biotynylowanych. W systemie tym wykorzystuje się wysokie powinowactwo streptawidyny do biotyny. Biotyna połączona jest z przeciwciałem drugorzędowym. Następnie dodaje się streptawidyne połączoną z enzymem (HRP, AP) i po dodaniu odpowiedniego supsrtatu powstaje reakcja barwna. Do jednej cząsteczki biotyny przyłącza się 3 cząsteczki streptawidyny i reakcja jest wzmocniona około 3 krotnie w porównaniu do standardowej metody.Ze względu na reakcje krzyżowe ze streptawidyna nie należy stosować do wysycania mleka.

Przejdź do: elektroforetyczny rodział białek; detekcja białek w żelu; western-blotting- podstawy teoretyczne; western-blotting- przepis

Autor: dr Joanna Skubis-Zegadło

Zapraszamy do dyskusji na ten temat na naszym forum http://metlab.pl/forum/topic67-transfer-bialek-na-membrane-i-immunodetekcja-bialek.html