Metody

Kategoria: Metody

Tagi: białka immunodetekcja przeciwciała

Data: 2009-02-23

Western-blotting- przepis

    elektroforetyczny rozdział białek

  1. Zmieszać składniki żelu w proporcjach podanych w tabeli
  2. skład żel 4% żel 9%
    woda 3 ml 4,3 ml
    1,5M Tris 1,25ml 2,5ml
    10% SDS 50µl 100µl
    30%akrylamid 0,625 ml 3ml
    10% persulfat (APS) 35µl 50µl
    TEMED 5µl 5µl

  3. 10% persulfat i TEMED inicjują proces polimeryzacji należy dodać je na końcu przed samym wylaniem żelu
  4. Na wylany żel dolny nanieść izobutanol (w celu usunięcia ewentualnych bąbli powietrza oraz aby zapobiec dostępowi powietrza, który utrudnia polimeryzację)
  5. Proces polimerycjacji prowadzić nie krócej niż 30 minut. Po tym czasie wypłukać izobutanol z góry żelu i delikatnie osuszyć go bibułą. Nie dopuszczając do przesuszenia górnej warstwy żelu wylać żel górny- zagęszczający i umieścić w nim grzebień tak, by w studzienkach nie było pęcherzyków powietrza.
  6. nanoszenie białek na żel

  7. Odpowiednią ilość białka (1ng-50µg) zawiesić w buforze do próbek. (Docelową objętość jaka ma być nałożona na studzienkę około 10-30 µl podzielić na pół. Jedną połowę stanowi bufor do próbek stężony 2x a drugą badana próbka rozcieńczona w odpowiedniej ilości wody, lub buforu do elektroforezy)
  8. Zredukować próbki poprzez dodanie: 1% merkaptoetanolu lub DTT (ditiotreitol). Redukcje prowadzić przez 5 minut w 100°C
  9. Bezpośrednio przed naniesieniem na żel próbkę należy odwirować aby usunąć wszystkie nierozpuszczone składniki.
  10. Nanieść badane białko oraz marker wielkości na studzienki w żelu poliakryloamidowym.
  11. Elektroforezę prowadzić w buforze do elektroforezy poczatkowo przy napięciu 80V -20 minut (mniejsze napięcie ma na celu wyrównanie ładunków w żelu oraz wolniejszą migrację białek w żelu zbierającym) a następnie przy napięciu prądu 150 V przez ok. 50 minut
  12. elektrotransfer

  13. Żel po elektroforezie inkubować przez około 10 min w buforze do blokingu
  14. Przygotować odpowiedniej wielkości: membranę i bibułę (Whatman), namoczyć je w buforze do blottingu.
  15. Membranę z fluorku poliwinylidenu (PVDF) należy aktywować poprzez 10 minutową inkubacje w metanolu. Następnie opłukać wodą i inkubować w buforze do blokingu. Membrane nitrocelulozową namoczyć w buforze do blokingu.
  16. Ułożyć "kanapkę" należy uważać aby nie pozostawić bąbelków powietrza pomiędzy żelem a membraną i nie pomylić kolejności warstw.
  17. Blotting prowadzić 2 godziny przy napięciu 100V.
  18. immunodetekcja białek

  19. Membranę po zakończonym transferze należy opłukać wodą destylowaną
  20. Inkubować z roztworem wysycającym od 1godziny w temperaturze pokojowej do nocy w chłodni w zależności od potrzeb
  21. Inkubować z roztworem przeciwciał pierwszorzędowych w TBST lub roztworze 1% mleka w TBST. Czas w zależności od potrzeb od godziny w temperaturze pokojowej do nocy w 4°C z mieszaniem.
  22. Płukać 6-10 razy po 5 min w TBST.
  23. Inkubować z roztworem drugorzędowych przeciwciał w TBST. Czas 1-2 godzin w temperaturze pokojowej.
  24. Płukać 6-10 razy po 5 min w TBST.
  25. Detekcja białek odczynnikami chemiluminescencyjnymi: Przygotować roztwór odczynników do chemiluminescencji.
  26. Membranę zawinąć w folię (włożyć w koszulkę foliową). Usunąć bąble powietrza
  27. Przyłożyć kliszę i wywołać ją odczynnikami do wywoływania klisz
Odczynniki:
  1. bufor do próbek – sb(sample buffer)–2xstężony, przepis wg. mercka(hefera)
    1. 125 mM TRIS-HCl o pH 6,8
    2. 4% SDS
    3. 20 %glicerol
    4. bromofenol blue (dodawać kroplami dla uzyskania odpowiedniego granatowego koloru)
  2. bufor do elektroforezy (5xstężony)
    1. 25mM Tris
    2. 192mM glicyna
    3. 0.1% SDS pH 8.3
  3. bufor wysycający
    1. roztwur 5% odtłuszczonego mleka w TBST
  4. TBST (1L)
    1. 3g Tris
    2. 8g NaCL
    3. 0.2g KCl
    4. 2ml Tween 20
    5. Dopełnić woda destylowaną do 1L
    6. doprowadzić pH 7.6

Przejdź do: elektroforetyczny rodział białek; detekcja białek w żelu; transfer białek na membranę i immunodetekcja białek; western-blotting- podstawy teoretyczne

Autor: dr Joanna Skubis-Zegadło

Zapraszamy do dyskusji na ten temat na naszym forum http://metlab.pl/forum/topic68-westernblotting-przepis.html