Western-blotting- przepis
- Zmieszać składniki żelu w proporcjach podanych w tabeli
- 10% persulfat i TEMED inicjują proces polimeryzacji należy dodać je na końcu przed samym wylaniem żelu
- Na wylany żel dolny nanieść izobutanol (w celu usunięcia ewentualnych bąbli powietrza oraz aby zapobiec dostępowi powietrza, który utrudnia polimeryzację)
- Proces polimerycjacji prowadzić nie krócej niż 30 minut. Po tym czasie wypłukać izobutanol z góry żelu i delikatnie osuszyć go bibułą. Nie dopuszczając do przesuszenia górnej warstwy żelu wylać żel górny- zagęszczający i umieścić w nim grzebień tak, by w studzienkach nie było pęcherzyków powietrza.
- Odpowiednią ilość białka (1ng-50µg) zawiesić w buforze do próbek. (Docelową objętość jaka ma być nałożona na studzienkę około 10-30 µl podzielić na pół. Jedną połowę stanowi bufor do próbek stężony 2x a drugą badana próbka rozcieńczona w odpowiedniej ilości wody, lub buforu do elektroforezy)
- Zredukować próbki poprzez dodanie: 1% merkaptoetanolu lub DTT (ditiotreitol). Redukcje prowadzić przez 5 minut w 100°C
- Bezpośrednio przed naniesieniem na żel próbkę należy odwirować aby usunąć wszystkie nierozpuszczone składniki.
- Nanieść badane białko oraz marker wielkości na studzienki w żelu poliakryloamidowym.
- Elektroforezę prowadzić w buforze do elektroforezy poczatkowo przy napięciu 80V -20 minut (mniejsze napięcie ma na celu wyrównanie ładunków w żelu oraz wolniejszą migrację białek w żelu zbierającym) a następnie przy napięciu prądu 150 V przez ok. 50 minut
- Żel po elektroforezie inkubować przez około 10 min w buforze do blokingu
- Przygotować odpowiedniej wielkości: membranę i bibułę (Whatman), namoczyć je w buforze do blottingu.
- Membranę z fluorku poliwinylidenu (PVDF) należy aktywować poprzez 10 minutową inkubacje w metanolu. Następnie opłukać wodą i inkubować w buforze do blokingu. Membrane nitrocelulozową namoczyć w buforze do blokingu.
- Ułożyć "kanapkę" należy uważać aby nie pozostawić bąbelków powietrza pomiędzy żelem a membraną i nie pomylić kolejności warstw.
- Blotting prowadzić 2 godziny przy napięciu 100V.
- Membranę po zakończonym transferze należy opłukać wodą destylowaną
- Inkubować z roztworem wysycającym od 1godziny w temperaturze pokojowej do nocy w chłodni w zależności od potrzeb
- Inkubować z roztworem przeciwciał pierwszorzędowych w TBST lub roztworze 1% mleka w TBST. Czas w zależności od potrzeb od godziny w temperaturze pokojowej do nocy w 4°C z mieszaniem.
- Płukać 6-10 razy po 5 min w TBST.
- Inkubować z roztworem drugorzędowych przeciwciał w TBST. Czas 1-2 godzin w temperaturze pokojowej.
- Płukać 6-10 razy po 5 min w TBST.
- Detekcja białek odczynnikami chemiluminescencyjnymi: Przygotować roztwór odczynników do chemiluminescencji.
- Membranę zawinąć w folię (włożyć w koszulkę foliową). Usunąć bąble powietrza
- Przyłożyć kliszę i wywołać ją odczynnikami do wywoływania klisz
elektroforetyczny rozdział białek
skład | żel 4% | żel 9% |
woda | 3 ml | 4,3 ml |
1,5M Tris | 1,25ml | 2,5ml |
10% SDS | 50µl | 100µl |
30%akrylamid | 0,625 ml | 3ml |
10% persulfat (APS) | 35µl | 50µl |
TEMED | 5µl | 5µl |
nanoszenie białek na żel
elektrotransfer
immunodetekcja białek
- bufor do próbek – sb(sample buffer)–2xstężony, przepis wg. mercka(hefera)
- 125 mM TRIS-HCl o pH 6,8
- 4% SDS
- 20 %glicerol
- bromofenol blue (dodawać kroplami dla uzyskania odpowiedniego granatowego koloru)
- bufor do elektroforezy (5xstężony)
- 25mM Tris
- 192mM glicyna
- 0.1% SDS pH 8.3
- bufor wysycający
- roztwur 5% odtłuszczonego mleka w TBST
- TBST (1L)
- 3g Tris
- 8g NaCL
- 0.2g KCl
- 2ml Tween 20
- Dopełnić woda destylowaną do 1L
- doprowadzić pH 7.6
Przejdź do: elektroforetyczny rodział białek; detekcja białek w żelu; transfer białek na membranę i immunodetekcja białek; western-blotting- podstawy teoretyczne
Autor: dr Joanna Skubis-Zegadło