Artykuły

Western blotting- teoria

Elektroforetyczny rozdział białek

Elektroforeza polega na rozdziale mieszaniny makrocząsteczek pod wpływem przyłożonego pola elektrycznego. Cząsteczki wędrują w żelu w zależności od ich ładunku, rozmiaru, kształtu oraz oporów ruchu środowiska (gęstości żelu). Elektroforezę najczęściej prowadzi się na żelach poliakrylamidowych.

Żele poliakrylamidowe używane w metodzie western-blot do rozdziału białek są polimerami akrylamidu i bis-akrylamidu.Od proporcij tych dwóch składników zależy gęstość i wymiary porów żelu. Wybór gęstości żelu uzależniony jest od wielkości i masy cząsteczkowej analizowanych cząsteczek. Wysoko cząsteczkowe białka rozdziela się na żelach o niższej gęstości natomiast nisko cząsteczkowe na żelach bardziej gęstych. Bardzo często żele poliakrylamidowe wzbogacane są w siarczan dodecylu –SDS (SDS-PEAGE). Dzięki któremu rozdział elektroforetyczny zachodzi ze względu na ciężar cząsteczkowy rozdzielanych białek a nie ich ładunek (SDS opłaszcza białka nadając im wypadkową ujemną wartość -przez co maskuje ich pierwotny ładunek). W polu elektrycznym ujemnie naładowane białka migrują w kierunku dodatniej elektrody.

Elektroforeza natywna białek

Elektroforeza natywna białek – jest przeciwieństwem elektroforezy w obecności czynników redukujących np. SDS. Próbka nakładana na żel rozpuszcza się w buforze nie powodującym denaturacji zawartych w niej białek.

Przygotowanie próbek do elektroforezy

Aby rozdział elektroforetyczny zachodził ze względu na ciężar białka próbkę przed nałożeniem na żel należy zredukować w odpowiednim buforze redukującym i temperaturze. W buforach redukujących stosuje się: merkaptoetanol lub DTT (ditiotreitol) oba związki redukują (przecinają) mostki dwusiarczkowe (S-S) pomiędzy białkami czyli denaturują drugorzędową strukturę białka. Taki zabieg ma na celu wykluczenie, że biako o większej masie ale bardziej „upakowane ” wędruje szybciej w żelu niż białko o mniejszej masie za to mniej „upakowane”. Dobry rozdział elektroforetyczny osiąga się wtedy, gdy objętość próbki nie przekracza 10% objętości ścieżki, a ilość białek nakładanych na studzienkę znajduje się w przedziale 1-50 µg. Ponadto próbka nie może zawierać zbyt dużej ilości soli, która w postaci zjonizowanej powoduje powstawanie smug i niejednorodności prążków.

Transfer białek na membranę

Rozdzielone elektroforetycznie białka przenosi się na błonę wiążącą białka np. nitrocelulozową lub z fluorku poliwinylidenu (PVDF). Transfer ten ma na celu lepszą identyfikację cząsteczek technikami immunobarwienia oraz ułatwienie pracy ponieważ membrana jest bardziej odporna na uszkodzenia mechaniczne niż żel. Elektrotransfer polega na przeniesieniu ujemnie naładowanych białek z żelu na membranę, pod wpływem przyłożonego napięcia prądu. Białka migrują w kierunku dodatniej elektrody i zostają zatrzymane na membranie umieszczonej za żelem co przedstawiono na rysunku poniżej.

Schemat elektroblottingu

Rysunek:Schemat elektroblottingu.

Białka, w postaci rozdzielonych prążków na różnych poziomach, są precyzyjnie przeniesione na membranę dając lustrzany obraz rozdzielonych w żelu polipeptydów.

Immunodetekcja białek

Membranę z przeniesionymi na nią białkami należy wysycić w celu zablokowania miejsc niespecyficznego wiązania przeciwciał. Najczęściej stosowanym roztworem wysycającym jest 5% odtłuszczone mleko w TBST. Innym roztworem jest alkohol poliwinylowy lub gotowe roztwory oferowane przez firmy biotechnologiczne. Wysycaną w ten sposób błonę inkubuje się z przeciwciałem pierwszorzędowym mającym wysokie powinowactwo do badanego białka.

schemat membrany po inkubacji z przeciwciałem pierwszorzędowym

Rysunek:Schemat: membrana po inkubacji z przeciwciałem pierwszorzędowym.

Po odpłukaniu nadmiaru przeciwciał membranę inkubuje się z przeciwciałem drugorzędowym, mającym powinowactwo do globuliny zwierzęcia z którego pochodzi przeciwciało pierwszorzędowe.

schemat membrany po inkubacji z przeciwciałem pierwszo i drugorzędowym

Rysunek:Schemat: membrana po inkubacji z przeciwciałem pierwszo i drugorzędowym.

Przeciwciało drugorzędowe związane jest z enzymem (HRP, AP), który po dodaniu odpowiedniego substratu powoduje reakcje barwną co przedstwiono na schemacie poniżej.

Immunodetekcja białek

Rysunek:Schemat: Immunodetekcja białek

Reakcja z przeciwciałami biotynylowanymi

Bardziej czułym systemem jest wykorzystanie przeciwciał biotynylowanych. W systemie tym wykorzystuje się wysokie powinowactwo streptawidyny do biotyny. Biotyna połączona jest z przeciwciałem drugorzędowym. Następnie dodaje się streptawidyne połączoną z enzymem (HRP, AP) i po dodaniu odpowiedniego supsrtatu powstaje reakcja barwna. Do jednej cząsteczki biotyny przyłącza się 3 cząsteczki streptawidyny i reakcja jest wzmocniona około 3 krotnie w porównaniu do standardowej metody.Ze względu na reakcje krzyżowe ze streptawidyna nie należy stosować do wysycania mleka.

Przejdź do: elektroforetyczny rodział białek; detekcja białek w żelu; transfer białek na membranę i immunodetekcja białek western-blotting -przepis

Autor: dr Joanna Skubis-Zegadło

Zapraszamy do dyskusji na ten temat na naszym forum http://metlab.pl/forum/topic72-western-blotting-teoria.html