Wprowadzanie DNA do wnętrza komórek

Przy użyciu lipofektaminy (LipofectAMINE)

1. Dzień przed planowanym doświadczeniem komórki rozsiać na 6-dołkową szalkę w gęstości 40-50%
2. Na 1 godz. przed transfekcją zmienić podłoże hodowlane na podłoże bez surowicy
3. Przygotować sterylny roztwór około 1.5 µg DNA w 100 µl pożywki bez surowicy oraz zawiesinę 7 µl lipofektaminy (LipofectAMINE, Gibco BRL) w 100 µl pożywki bez surowicy, a następnie je połączyć
4. Inkubować 30 minut lipofektaminę + DNA w temperaturze pokojowe. Otrzymany roztwór nanieść na dołek zawierający hodowane komórki, dodać 800 µl pożywki bez surowicy i inkubować przez 3 godziny (37°C, 5% CO2)
5. Po tym czasie dodać 1 ml pożywki z 10% surowicą i kontynuować inkubację
6. Następnego dnia komórki przepłukać roztworem PBS i dodać nowe podłoże hodowlane
7. Po 48 godzinach od transfekcji, do podłoża dodać antybiotyk selekcyjny neomycynę (G418) do stężenia końcowego 800 µg/ml i od tej pory komórki hodowć zawsze w obecności tego antybiotyku.

Autor: dr Magdalena Kowalczyk