Metody

Znakowanie przeciwciał pierwszorzędowych enzymem (fosfatazą alkaliczną)

Bezpośrednie metody immunologiczne wymagają użycia wyznakowanego (związanego z odpowiednim enzymem) przeciwciała pierwszorzdorzędowego. Poniżej zamieściłam prostą metodę łączenia przeciwciał z fosfatazą alkaliczną za pomocą glutaraldehydu.

  1. Zmieszaj 10 mg przeciwciał z 5 mg fosfatazy alkaliczej w końcowej objętości 1ml
  2. Przenieś mieszaninę mieszaninę enzym-przeciwciało do odpowiedniej probówki (ok 5-10 ml). Postaw mieszaninę na mieszadle magnetycznym i delikatnie mieszaj
  3. Powoli dodaj 0,05ml 1% glutaraldehydu. Pozostaw na mieszadle przez 5 minut. A nastepnie inkubuj przez 3 godniny bez mieszania
  4. Dodaj 0,1ml 1M etanoloaminy (pH 7). Pozostaw na dwugodzinną inkubację w temperaturze pokojowej
  5. Dializuj mieszaninę noc w 4°C w trzech zmianach PBS lub zastosuj filtrację żelową na złożu o poraz z odcięciem 20,000-50,000 daltonów
  6. Zwiruj mieszninę 40,000xg przez 20 minut
  7. Nadsącz przechowuj w 4°C w obecności: 50% glicerolu, 1mM MgCl2 i 0,02% azydku sodu.

Autor: dr Joanna Skubis-Zegadło

Na podstawie: antibodies manual

Zapraszamy do dyskusji na ten temat na naszym forum http://metlab.pl/forum/topic56-znakowanie-przeciwcial-pierwszorzedowych-enzymem-fosfataza-alkaliczna.html